拮抗內源性孤啡肽可通過下調microRNA-1途徑抑制大鼠再灌注性心律失常

熊 暢,任曉芬,韓 毅，2,王一迪,李占峰

(1. 山西醫(yī)科大學麻醉學系,山西 太原 030000；2. 山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院麻醉科，山西 太原 030001)

目前，臨床治療急性心肌梗死患者最有效的方式是恢復梗死區(qū)血運，然而，在血流再通后可出現(xiàn)缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury, IRI)。再灌注性心律失常(reperfusion arrhythmia, RA)是心肌IRI最重要的臨床表現(xiàn)，是目前臨床判斷血流恢復的指標之一，但同時惡性RA也是導致患者預后不良，甚至死亡的重要原因[1-2]。

microRNAs是非編碼微小RNA，能夠從轉錄后水平調節(jié)心肌離子通道及傳導結構的表達。研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs對于心肌細胞鈉、鉀、鈣等多種離子通道，以及心肌傳導結構如縫隙連接等均能發(fā)揮調節(jié)作用。病理條件下，異常表達的各種微小RNA通過調控離子通道以及傳導結構，引起心肌電重構以及結構重構，直接導致各種心律失常的產生[3-4]。microRNA-1(miR-1)是目前發(fā)現(xiàn)的一種肌肉特異性微小RNA，已有實驗證明心肌缺血狀態(tài)下升高的miR-1能夠抑制GJA1(編碼connexin 43, Cx43)以及KCNJ2(編碼內向整流鉀通道的核心亞基kir2.1)基因表達，導致心律失常的發(fā)生[5]。

孤啡肽(nociceptin/orphanin FQ, N/OFQ)是一種具有神經(jīng)遞質功能的內源性阿片肽，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌缺血后，心肌組織N/OFQ表達明顯增多，并且拮抗內源性N/OFQ能夠發(fā)揮抗缺血性心律失常作用[6]，但其是否參與RA的發(fā)生尚不清楚。本研究擬觀察內源性N/OFQ對RA、miR-1及其下游靶點的影響，探討內源性N/OFQ對RA的作用及其調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級健康成年SD大鼠24只，♂，體質量(260±20)g，購自中國人民解放軍軍事科學研究院實驗動物中心，許可證號：SCXK(軍)2012-0004，適應性喂養(yǎng)1周。動物實驗已通過山西醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.1.2試劑 UFP-101(Tocris Cookson公司)；TRIzol(TaKaRa公司)；cDNA合成試劑盒(Thermo Scientific公司)；SYBR Green qPCR Master Mix(2×)(Fermentas公司)；抗Cx43、kir2.1、GAPDH抗體(Abcam公司)。

1.1.3儀器 AlC-V8小動物呼吸機(上海澳爾科特公司)；RM6240BD電生理信號記錄儀(成都儀器廠)；MX3005P實時熒光定量PCR儀(上海拜力生物科技有限公司)；ChemiDocXRS凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2動物模型的建立及分組用隨機數(shù)字表法分為3組(n=8)：假手術組(Sham組)、缺血/再灌注組(I/R組)和孤啡肽受體拮抗劑UFP-101預處理組(U+I/R組)。Sham組僅開胸穿線，但不結扎冠脈；I/R組結扎左冠狀動脈前降支缺血30 min，隨后再灌注120 min；U+I/R組在再灌注前10 min經(jīng)尾靜脈按1 μL·g-1注射特異性孤啡肽受體拮抗劑UFP-101(10-9mol·L-1)，其余2組給予等容量生理鹽水。大鼠稱重后，以質量分數(shù)為25%的烏拉坦(1.25 g·kg-1)進行腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于操作臺上，連接生物信號采集系統(tǒng)，記錄標準Ⅱ導聯(lián)心電圖。氣管切開置入氣管導管，連接小動物呼吸機施行機械通氣，呼吸機潮氣量設為8 μL·g-1，呼吸頻率70次/min。穩(wěn)定15 min后，在左側第4肋間隙開胸，以5-0無損傷縫線的彎針從左心耳右緣進針，肺動脈圓錐左緣出針以套管結扎左冠狀動脈前降支。而后可見Ⅱ導聯(lián)心電圖出現(xiàn)ST段逐漸抬高，并漸與QRS波融合，心肌前壁組織顏變蒼白色隨后紫紺，可有心律失常出現(xiàn)，提示造模成功。缺血30 min后，松開結扎線使血管再通(松開套管前10 min經(jīng)尾靜脈給予UFP-101或等量生理鹽水)，心外膜出現(xiàn)充血，同時心電圖ST段有所回落，心肌呈再灌注狀態(tài)，再灌注120 min后處死大鼠，取缺血區(qū)心肌。

1.3心律失常統(tǒng)計及評分對心律失常進行評定(Fig 1)，記錄再灌注后室性早搏(ventricular ectopic beats, VEB)的發(fā)生個數(shù)(包含單發(fā)室早、室早二聯(lián)律和三聯(lián)律)、室速(ventricular tachycardia, VT)和室顫(ventricular fibrillation, VF)的發(fā)生次數(shù)以及持續(xù)時間，并根據(jù)參考文獻[7]對大鼠心律失常進行評分。評分標準如下，0分，共出現(xiàn)<50個VEB(包括室早二聯(lián)律、室早三聯(lián)律)；1分，出現(xiàn)≥50個VEB；2分，出現(xiàn)1～5次VT；3分，出現(xiàn)≥ 6次VT；4分，出現(xiàn)1次可逆性VF；5分，出現(xiàn)2～5次可逆性VF；6分，出現(xiàn)不可逆性VF。

Fig 1 Examples of arrhythmias

A: Normal ECG; B: VEB; C: Bigeminy; D: Trigeminy; E: ST elevation; F: VT; G: VF.

1.4qRT-PCR檢測將液氮保存的心肌組織加入DEPC水處理過的研缽中，持續(xù)加入液氮研磨至粉末。稱取20～30 mg心肌，利用TRIzol提取總RNA，然后逆轉錄合成cDNA，再按SYBR Green qPCR Master Mix(2×)試劑盒步驟進行擴增。引物由TaKaRa生物有限公司合成(Tab 1)。miR-1采用U6作為內參基因，Cx43、kir2.1 mRNA采用GAPDH基因作為內參。反應條件，預變性：95 ℃ ，60 s；擴增(40個循環(huán))：95 ℃，20 s；57 ℃，30 s；72 ℃，60 s；熔解曲線：95 ℃，30 s；60 ℃，60 s；95 ℃，30 s。在每個循環(huán)延伸末收集熒光信號，繪制擴增曲線，檢測各樣本的域值循環(huán)數(shù)(CT值)，以2-△△CT法對目的基因進行相對定量分析。

Tab 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.5Westernblot檢測將液氮中保存的心肌切成小塊，將部分組織按10 mg加100 μL蛋白裂解液，冰上孵育并振蕩充分裂解，4 ℃、12 000×g離心30 min，取上清液，分裝-80 ℃保存。分裝蛋白利用BCA法進行蛋白定量，依次進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入一抗Cx43(1 ∶2 000)、kir2.1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 500)搖勻后，4 ℃孵育，搖床過夜，加入二抗HRP-IgG(1 ∶2 500)，室溫孵育1 h 。TBST清洗，3次×10 min。將PVDF膜條帶表面滴加ECL顯影液，放入凝膠成像儀暗室中，應用Quantity One圖像分析軟件測定各蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內參反映其相對表達水平。

2 結果

2.1動物模型建立情況實驗過程出現(xiàn)心律失常只做記錄，未進行抗心律失常處理。共27只大鼠參與實驗過程，其中因實驗操作不當或結果有誤棄除3只，剩余24只大鼠均存活至實驗結束。

2.2心律失常發(fā)生情況如Tab 2所示，與Sham組比較，I/R組以及U+I/R組均出現(xiàn)明顯的再灌注性心律失常(P<0.01)。與I/R組比較，U+I/R組再灌注期間室早次數(shù)、室速和室顫發(fā)生次數(shù)、持續(xù)時間及致心律失常評分明顯下降(P<0.01)，而室速和室顫的發(fā)生率稍有減少，但差異無統(tǒng)計學意義。

2.3拮抗內源性N/OFQ對心肌miR-1表達的影響如Fig 2所示，與Sham組相比，I/R組心肌miR-1表達明顯增多(P<0.01)；與I/R組相比，U+I/R組miR-1表達明顯下降(P<0.05)。

Fig 2 miR-1 expression at 120 min after n=8)

*P<0.05,**P<0.01vssham;#P<0.05vsU+I/R

2.4拮抗內源性N/OFQ對心肌Cx43、Cx43mRNA以及kir2.1、kir2.1mRNA的影響與Sham組相比，I/R組Cx43、Cx43 mRNA以及kir2.1表達降低(P<0.05)，kir2.1 mRNA降低無統(tǒng)計學意義。與I/R組相比，U+I/R組Cx43、kir2.1表達明顯增加(P<0.05)，Cx43 mRNA及kir2.1 mRNA表達雖有增多，但差異無統(tǒng)計學意義(Fig 3、4)。

3 討論

RA是血運重建后發(fā)生的二次損傷，影響患者預后，甚至導致死亡，多種因素參與其病理生理過程。再灌注早期，心肌表現(xiàn)為氧自由基增多、鈣超載、炎癥因子聚集等，與此同時，心臟自主神經(jīng)以及感覺神經(jīng)被激活，釋放多種神經(jīng)遞質/調質，共同參與再灌注后心臟的損傷與保護，其中N/OFQ即是心臟感覺神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽之一[8-9]。

N/OFQ及其受體廣泛分布于機體多種組織器官，包括心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)等，參與疼痛、抑郁、免疫等多種病理生理過程[10]。孤啡肽受體(NOP/ORL1)與經(jīng)典阿片受體存在高度同源性，但其功能與三大經(jīng)典阿片受體(μ、δ、κ)卻截然不同，故又稱為孤兒阿片受體(ORL1)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，N/OFQ對神經(jīng)細胞多種離子通道均能發(fā)揮抑制作用[12]，本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，N/OFQ能夠調節(jié)大鼠心肌細胞動作電位時程，參與缺血性心律失常過程[6]。而缺血/再灌注狀態(tài)下，N/OFQ能否影響RA的發(fā)生尚無報道。本研究結果表明，拮抗內源性N/OFQ同樣可降低再灌注后VEB、VT、VF等快速性心律失常的發(fā)生。

Tab 2 Comparison of cumulative reperfusion-induced arrhythmias in

**P<0.01vssham;##P<0.01vsU+I/R

Fig 3 Expression of kir2.1 and Cx43

*P<0.05,**P<0.01vssham;#P<0.05vsU+I/R

Fig 4 Expression of KCNJ2 and GJA1

*P<0.05vssham

既往研究表明，心肌缺血狀態(tài)下，miR-1表達增多能夠抑制Cx43及kir2.1蛋白表達，引起電生理紊亂[4-5]。Cx43是心肌細胞間電信號傳導的重要連接蛋白，是心肌同步化收縮的結構基礎，而kir2.1蛋白則是內向整流鉀通道(IK1)的核心亞基，對于心肌細胞靜息電位的維持有著重要影響。然而，再灌注期間，miR-1的表達是增多還是降低，尚有不同結果報道[13-14]。本研究通過制備大鼠缺血/再灌注模型，結果顯示，再灌注120 min后，心肌miR-1表達明顯增多，并發(fā)現(xiàn)其下游靶點Cx43、kir2.1表達出現(xiàn)轉錄后抑制表現(xiàn)。由此推測，再灌注后miR-1的增多可導致Cx43及kir2.1表達抑制，進而引起RA，本結果與文獻報道一致[14]。

在明確N/OFQ以及miR-1均是RA的影響因素后，本研究根據(jù)前期研究結果，選擇特異性孤啡肽受體拮抗劑UFP-101最佳劑量(10-9mol·L-1, 1 μL·g-1)進行尾靜脈注射給藥[6]。結果顯示，拮抗內源性N/OFQ后，miR-1的表達水平明顯下降，并且Cx43及kir2.1表達有所上調。結果提示內源性N/OFQ是導致再灌注期間miR-1上調的原因之一，而N/OFQ對于RA的調控很可能是通過上調miR-1，抑制Cx43及kir2.1表達而實現(xiàn)。值得注意的是，本實驗通過比較Cx43 mRNA及kir2.1 mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)再灌注后Cx43 mRNA同樣發(fā)生明顯下降，而kir2.1 mRNA則未發(fā)生明顯變化。這提示再灌注后Cx43的表達除了受到miR-1存在于轉錄后水平的調節(jié)，在轉錄水平還受到其他因素影響其表達，而缺血/再灌注過程β腎上腺素能受體信號通路的過度激活可能就是影響因素之一[15]。

綜上所述，內源性N/OFQ能夠上調miR-1，抑制心肌細胞Cx43及kir2.1的表達，進而導致RA。本研究發(fā)現(xiàn)了內源性孤啡肽受體信號通路調節(jié)心肌損傷過程中的微小RNA機制，能夠為其他感覺神經(jīng)肽以及經(jīng)典阿片受體系統(tǒng)調控心肌損傷與保護提供新的思路。

(致謝：本實驗在山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院麻醉實驗室完成，感謝梁蔚駿老師的支持和幫助，也感謝實驗室各位同學的指導與幫助！)