益生菌副干酪乳桿菌R8雙層包埋工藝研究

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(1.廣東環凱微生物科技有限公司,廣東廣州 510663;2.廣東省微生物研究所,廣東廣州 510070)

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)為益生菌中乳桿菌屬的干酪乳桿菌,有良好的耐酸及膽汁抗性,具有能調節腸道生態平衡、增強免疫力、抗腫瘤、降膽固醇、降血壓和預防糖尿病發生等生理功能[1],以其為原料開發功能食品具有明確的保健意義。但益生菌在生長過程中,不形成芽孢,抗性較差,貯存穩定性差,其保健功效損失快。為提高加工和儲存過程中的穩定性,確保最多的活菌數達到腸道才釋放,從而發揮益生菌的最大功能活性,將益生菌經微膠囊技術包埋是有效的方法之一。

微膠囊化技術是采用天然或合成的高分子材料為囊材,通過化學、物理或物理化學法將活性物質即囊芯包裹起來形成半透性或密封性囊膜的微型膠囊[2]。然而一些研究表明[3],微囊化對益生菌在胃液中的存活并沒有顯現出較好的保護效果。因此研究者們主要通過3種手段提高微囊對活菌的保護效果:第一種是通過在微囊表面進行包衣[4];第二種是使用多種壁材復配[5-6];第三種是在壁材中加入益生元,提高益生菌對不利生長環境的適應性,從而提高其存活率[7]。制得的微膠囊主要有儲集型、基質型和涂層基質型三種類型。其中芯材被壁材膜完全包被的為儲集型微膠囊,芯材被分散在壁材內部和表面的為基質型微膠囊,涂層基質型微膠囊則是前兩者的結合[8]。其中,雙層包埋制得的涂層基質型微囊較多。

本試驗中研究的乳酸菌R8,為本試驗室經過抗性篩選、馴化選育的優良菌種,并鑒定為副干酪乳桿菌[9]。目前該菌種經高密培養的發酵工藝研究、放大工藝優化,可實現250 L規模的發酵生產[10]。為進一步提高R8的穩定性,并實現在腸道定向釋放的目的,本試驗采用多種手段增強微囊對益生菌的保護作用,擬將蛋白質和海藻酸鈉復配為首層包埋壁材,然后在固定液中用殼聚糖覆膜,制備雙層包埋的涂層基質型微囊微膠囊,使在益生菌周圍形成致密的物理屏障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副干酪乳桿菌R8 廣東省微生物研究所篩選馴化提供[9];MRS培養基(g/L):葡萄糖20.0 g,胰蛋白胨10.0 g,牛肉膏8.0 g,酵母粉4.0 g,Tween80 1.0 mL,K2HPO42.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,MnSO4·4H2O 0.05 g,檸檬酸銨2.0 g,CH3COONa·3H2O 5.0 g,蒸餾水1000 mL,pH6.2;乳糖、海藻酸鈉、殼聚糖 食品級,廣東大地食用化工有限公司;脫脂乳粉 食品級,廣州碩維食品技術有限公司;豆粉 食品級,深圳市圣菂科技有限公司;香蕉、雞蛋 市售;氯化鈣 食品級,鄭州瑞普生物工程有限公司;低聚半乳糖(95S)、低聚果糖(90S) 量子高科(中國)生物股份有限公司;菊粉 山東保齡寶生物技術有限公司。

Avanti J-20XP離心機 美國貝克曼庫爾特公司;YC-015實驗型噴霧干燥機 上海雅程儀器設備有限公司;LGJ-1冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠;UV-1800全波長掃描分光光度計 日本島津公司;HZQ-F100振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 凍干保護劑種類的篩選 根據前期預實驗,所篩選的乳酸菌凍干保護劑有10%乳糖、10%脫脂乳粉、10%豆粉、20%香蕉、20%全蛋水溶液。

副干酪乳桿菌R8經活化、發酵培養[11]后,經離心(8000 r/min,4 ℃離心10 min)收集的菌泥(干重計活菌數1.83×1011cfu/g)分別加入上述凍干保護劑的水溶液中,空白組以蒸餾水代替保護劑,菌泥終濃度為5%,充分混勻后將菌泥平鋪在培養皿中,在超低溫冰箱中-20 ℃預凍5～6 h后進行真空冷凍干燥,根據菌泥含水量估算干燥時間,主干燥階段-30 ℃;終干燥階段-40 ℃,最終菌粉水分<5%。凍干后測定用稀釋平板計數法[12]檢測活菌數,根據公式(1)計算得存活率,考察凍干保護劑對菌體凍干存活率的影響[13]。

式(1)

1.2.2 凍干保護劑對菌體儲藏穩定性的影響 將添加不同保護劑冷凍干燥后的菌粉,分別在室溫放置4個月,在4 ℃和-20 ℃放置1年,每月檢測菌粉的活菌數,從而考察不同凍干保護劑對菌體儲藏穩定性的影響。

1.2.3 益生元的篩選 以MRS培養基作為對照,試驗組分別用2%低聚半乳糖、2%低聚果糖和2%菊粉替代MRS培養基中的葡萄糖,其他成分不變。將活化后的菌液以2%(V/V)接種量接入各培養基,37 ℃靜置恒溫發酵10 h后檢測發酵液中的活菌數,確定出最適益生元[14]。

1.2.4 微膠囊的制備

1.2.4.1 制備乳化液 無菌操作條件下,準確稱取菊粉和全蛋液,加水混勻,使菊粉終濃度為2%,全蛋液終濃度為20%;再加入5%菌泥攪拌均勻;后加入不同濃度(終濃度0.3%、0.5%、1%、1.5%)的海藻酸鈉溶液繼續攪拌,至形成均勻乳化液[8,15]。

1.2.4.2 固化 用噴霧干燥機在壓力0.2～0.3 MPa,流速30 mL/min(水)的條件下將乳化液噴入含有不同濃度CaCl2(終濃度1%、2%、2.5%)和0.5%殼聚糖乙酸溶液中,固化30 min,形成微膠囊[8,15]。

1.2.4.3 干燥 固化處理后,8000 r/min離心10 min,立即進行冷凍干燥,即得成品。其中冷凍干燥時,先-20 ℃預凍5 h,主干燥階段-30 ℃;終干燥階段-40 ℃,最終菌粉水分<5%[8,15]。

1.2.4.4 微膠囊包封率的測定 1%海藻酸鈉與全蛋液制備乳化液后,再于2.5%氯化鈣溶液中固化,通過考馬斯亮藍比色法[16]測定固化液中剩余蛋白的含量,根據公式(2)計算得包封率,篩選出最優包埋組合[15]。

包封率(%)=(總乳蛋白OD值-上清液中乳蛋白OD值)/總蛋白OD值

式(2)

1.2.5 微膠囊釋放特性的測定

1.2.5.1 人工模擬液的制備 人工胃液:鹽酸16.4 mL,胃蛋白酶10 g,加水攪勻后定容至1000 mL,pH=1.5。

人工腸液:磷酸二氫鉀6.8 g,加水500 mL溶解,用0.4%的氫氧化鈉溶液調節pH至6.8,另取胰酶10 g加水適量使其溶解,將兩液混合后,加水定容至1000 mL。

1.2.5.2 微膠囊在人工模擬液的耐酸性試驗和腸溶性試驗 耐酸性試驗:稱1 g微膠囊加入裝有100 mL人工胃液的三角瓶中,于搖床中以(37±1) ℃、150 r/min處理,0、0.5、1.0、1.5、2、2.5 h取樣用分光光度計測定600 nm波長下的OD值,測其透光率,根據透光率變化分析人工胃液中微膠囊的溶出情況[17]。

透光率=(人工胃液實時OD值-人工胃液初始OD值)/人工胃液初始OD值

腸溶性試驗:稱1 g微膠囊加入裝有100 mL人工腸液的三角瓶中于搖床中以(37±1) ℃、150 r/min崩解。分別于 15、30、45、60 min取樣用分光光度計測定600 nm波長下的OD值,根據透光率的變化分析人工腸液中微膠囊的溶出情況。于試驗終點測定模擬腸液中的活菌數[17]。

1.3 數據處理

所有數據采用SPSS 13.0進行方差分析,結果均以均數±標準差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗,以p<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 凍干保護劑種類的篩選

菌體冷凍干燥后其活力變化的結果如圖1所示:菌體不加凍干保護劑直接凍干后存活率僅為12.7%,說明冷凍干燥過程對菌體活力的影響較大;而不同保護劑對菌體均有極顯著的保護作用(p<0.01),其作用大小排序為:20%全蛋液>10%脫脂奶粉>10%豆粉>10%乳糖>20%香蕉,其中添加20%全蛋液后的凍干存活率是無保護劑時的5倍。

圖1 不同凍干保護劑對菌體凍干后活力的影響Fig.1 Effects of different freeze-dried protective agentson the viability of mycelia after freeze 注:**代表與空白對照組數據之間差異極顯著(p<0.01)。

2.2 凍干保護劑對凍干菌粉儲藏穩定性的影響

在應用雙層包埋技術以提高益生菌數量和質量的穩定性時,是在益生菌表面先包覆蛋白質,然后再包一層特殊膠體[4],可見,蛋白質除了為凍干保護劑外,還考慮用作微囊的壁材,因此,進一步考察富含蛋白質的脫脂奶粉、豆粉和全蛋液作為凍干保護制備菌體凍干粉后的儲藏穩定性。試驗結果見圖2。

添加不同保護劑后制得的凍干菌粉,在室溫條件貯存,活菌數逐月下降,且第1個月下降速率較快,然后逐漸趨緩,貯存3個月時添加不同保護劑的菌體活菌數均已降至106cfu/g,4個月后各菌粉活菌數均已降至103cfu/g以下,于觀察終點,以20%全蛋液為保護劑制得的凍干菌粉活菌數最多。

添加不同保護劑后制得的凍干菌粉在4 ℃貯存1年的過程中,前6個月活菌數均較穩定,從第7個月開始有逐月下降的趨勢;其中,全蛋液為保護劑時,活菌數下降速率比另外兩種保護劑制得的菌粉活菌數下降更快,但得益于其起始活菌數高于后兩者,儲存1年后,其活菌數仍最多。

添加不同保護劑后制得的凍干菌粉,在-20 ℃條件下貯存較穩定,貯存1年后活菌數均維持在1010cfu/g以上。同時試驗結果也表明,以全蛋液為保護劑制得的凍干菌粉,儲存1年后的活菌數均較10%脫脂奶粉和10%豆粉為保護劑制得的凍干菌粉多。

綜上所述,以20%全蛋液為凍干保護劑制得的凍干菌粉凍干存活率最高,且置不同溫度的儲存條件下,于考察時間終點其菌粉活菌數均為最高,因此選取20%全蛋液為最佳凍干保護劑。

2.3 益生元的篩選

用不同的益生元代替培養基中的葡萄糖后,均能作為碳源被菌體所利用,其中2%菊粉效果最好,發酵后活菌數略高于原培養基,但無統計學差異,結果詳見圖3。因此,考慮將菊粉添加至微膠囊包埋的乳化液中,以促進活菌釋放后的生長。

圖3 添加不同益生元對菌株的生長促進作用Fig.3 Growth promoting effects of different prebiotics on 注:**:與2%葡萄糖組相比差異極顯著,p<0.01。

2.4 微膠囊包材對包封率的影響

制得的微膠囊包封率檢測結果如圖4所示:海藻酸鈉在0.3%～1%濃度范圍內的相同濃度下,隨著氯化鈣濃度的升高,包封率逐漸增大;當海藻酸鈉濃度達1.5%時,隨著氯化鈣的濃度升高,包封率反而下降;這可能跟溶液粘稠度有關,海藻酸鈉濃度越高,溶液越粘稠,越不利于與氯化鈣的充分接觸,難以形成均一的保護層。

圖4 菌體微膠囊包封率的測定Fig.4 Determination of encapsulation

當海藻酸鈉濃度為1.5%,氯化鈣濃度為1%時,微膠囊包埋率最高,達78.09%;當海藻酸鈉濃度為1%,氯化鈣濃度為2.5%時,微膠囊亦具有良好的包埋作用,包埋率達77.60%;將兩者數據進行t檢驗,不具統計學差異。綜合考慮包埋液添加菌泥后的濃稠度,最終選取海藻酸鈉濃度為1%,氯化鈣濃度為2.5%為最優包埋組合。

2.5 微膠囊特性的測定

2.5.1 微膠囊耐酸性試驗結果 由圖5可看出微膠囊在人工胃液中透光率的變化情況:微囊與人工胃液接觸0.5 h后,透光率顯著下降(p<0.05),1 h后則趨勢變緩,隨后各時間點抽樣檢測結果與1 h比較,無顯著差異(p>0.05),整個處理過程透光率變化幅度不大,約5%。因此可以證明益生菌微膠囊能夠耐受胃液的破壞[18]。

圖5 微膠囊的耐酸性Fig.5 Acid resistance of microcapsules注:*:與0 h相比差異顯著,p<0.05;**:與0 h相比差異極顯著,p<0.01。

2.5.2 微膠囊腸溶性試驗結果 由圖6可知,微囊與模擬腸液接觸45 min后透光率基本保持不變,且45 min和60 min后透光率無統計學差異,表明微膠囊中的益生菌在模擬腸液中45 min內釋放完畢[18]。于試驗終點測定模擬腸液中的活菌數,結果見表1,益生菌釋放完畢后,模擬腸液活菌數為原微囊活菌數的65.6%。

圖6 微膠囊的腸溶性Fig.6 Enteric solubility of microcapsules

表1 R8微囊置模擬腸液中的存活率Table 1 The survival rate of probiotic in microcapsule under simulated intestinal

3 結論

采用噴霧法制備耐受胃液且具有腸道定向釋放功能的副干酪乳桿菌R8微膠囊的最佳包埋液配方為:5%益生菌、2%菊粉、20%全蛋液、1%海藻酸鈉;最佳固化液配方為:2.5% CaCl2。

副干酪乳桿菌R8與全蛋液、海藻酸鈉混和均勻,進行第一層包埋,益生菌作為芯材被分散在壁材內部和表面;然后在進行固化的過程中,殼聚糖將首層的包埋材料覆膜,最終制得涂層基質型微膠囊。經上述工藝制得微膠囊可耐受胃液破壞,在模擬腸環境中45 min內釋放完畢;益生菌釋放完畢后,模擬腸液活菌數為原微囊活菌數的65.6%。

據試驗結果可見,全蛋液既為凍干保護劑,亦為包埋壁材,在制備工藝過程起到保護作用,并提高在儲存過程中的穩定性;將菌體/蛋白質/海藻酸鈉微膠囊進一步用殼聚糖材料進行覆膜,可實現在腸道定向釋放的目的。