天麻水提物活性成分分析及其抗氧化活性

,,,,, ,,,,*

(1.陜西理工大學生物科學與工程學院,陜西省天麻山茱萸工程技術研究中心,陜西理工大學中德天然產物研究所,陜西漢中 723000;2.陜西百圣生物工程有限公司,陜西漢中 724300)

天麻(GastrodiaelataBl.)又名赤箭、定風草、水洋芋等,為蘭科天麻屬多年生草本植物,是一種名貴的中藥材,屬國家三級保護物種,藥用部位為其塊莖[1],其性平、味甘,具有息風止痙、祛風通絡、平抑肝陽等功效,用于治療頭痛眩暈、小兒驚風、癲癇、抽搐、肢體麻木、破傷風等病癥[2]。此外,天麻還可作為食品原料,可用以加工天麻酒、天麻面、天麻糕點、天麻片、天麻絲、天麻糖、天麻茶等[3]。

天麻中含有天麻素、天麻苷元、天麻多糖、蛋白質、氨基酸以及鉻、錳、鐵、錫等微量元素等多種成分[4-5],其中最主要的活性成分是天麻素,天麻素易溶于水、甲醇和乙醇。目前天麻的功能及藥理活性研究中均以醇提物為主,但醇提法相比較水提法成本高,易污染環境[6-7]。水作為強極性溶劑,水提法具有安全、成本低廉的特點。目前有關天麻水提物的相關研究較少,王亞男等[8]對天麻水提取物開展了研究,分離鑒定了天麻水提物中23個化合物的化學結構,而有關天麻水提物的主要營養和活性成分及抗氧化活性的研究尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天麻 陜西省漢中市略陽縣,經陜西理工大學生物科學與工程學院王勇博士鑒定；DPPH 日本東京化成工業株式會社;沒食子酸 北京索萊寶科技有限公司;蘆丁 國藥集團;天麻素、對羥基苯甲醇、葡萄糖 中國食品藥品檢定研究院;福林-酚試劑 合肥華耐施生物公司;乙腈、磷酸 天津市科密歐化學試劑有限公司;單體酚 上海詩丹德生物技術有限公司。

RV10型旋轉蒸發儀 德國IKA公司;4802S紫外分光光度計 龍尼柯上海儀器有限公司;Alpha1-2型冷凍干燥機 德國Christ;Rotina 420R臺式離心機 德國Hettich;722G可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;Allegra 64R型離心機 美國貝克曼庫爾特公司;KND-B凱氏定氮儀 上海新嘉電子有限公司;U-3000高效液相色譜儀 Thermo公司;電感藕合等離子質譜(ICP-MS) 美國Thermo Fisher Scientific公司;WX-8000微波消解儀 上海屹堯儀器科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理及提取物制備 天麻炮制處理參考本團隊已建立的方法[9]。干天麻粉,按料液比1∶37 g/mL加蒸餾水,熱回流提取90 min,重復提取2次,合并3次濾液,濾液冷卻至室溫,4 ℃,10000 r/min離心10 min,活性炭脫色,45 ℃減壓濃縮,冷凍干燥24 h得天麻水提物干粉。

1.2.2 天麻水提取物的常規理化和營養成分含量測定 根據國家標準中規定的方法測定天麻的水分[10]、灰分[11]、淀粉[12]、脂肪[13]含量。采用凱氏定氮法測定[14]蛋白質含量,差減法[15]測定碳水化合物含量。

1.2.3 礦物質含量測定 采用電感耦合等離子發射光譜法(ICP-MS)測定[16]礦物質元素含量。

1.2.4 氨基酸組成及含量測定 采用蛋白水解液氨基酸分析系統測定氨基酸含量,參照徐頂巧等[17]方法。

1.2.5 天麻水提物中總多酚、總黃酮和原花青素含量測定 采用Folin-Ciocalteu比色法[18]測定總多酚含量,橫坐標為沒食子酸質量濃度(mg/mL),縱坐標為吸光度,標準曲線回歸方程y=0.0628x+0.0684,R2=0.9990。采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[19]測定總黃酮含量,橫坐標為蘆丁質量濃度(mg/mL),縱坐標為吸光度,標準曲線回歸方程y=0.0027x+0.0007,R2=0.9995。采用香草醛-鹽酸法[20]測定原花青素的含量,橫坐標為香草醛質量濃度(mg/mL),縱坐標為平均吸光度,標準曲線回歸方程y=24.97x+0.008(R2=0.9990)。

1.2.6 天麻素和對羥基苯甲醇含量測定 天麻素和對羥基苯甲醇含量測定參考中國藥典2015版的方法進行測定[21]。色譜條件:色譜柱:Inertsil/WondaSil C18(250 mm×4.6 mm,4 μm),流動相:乙腈(A),0.05%的磷酸(B),A∶B=3∶97,流速:1 mL/min,檢測波長:220 nm,進樣量:10 μL,檢測溫度:25 ℃,HPLC的總運行時間為20 min。

1.2.7 多酚組成分析 色譜條件[22]:色譜柱:Inertsil/WondaSil C18(250 mm×4.6 mm,4 μm),流動相乙腈(A)和質量分數0.2% 的冰乙酸,檢測波長280 nm和254 nm,流速0.8 mL/min,進樣量10 μL,檢測溫度25 ℃,HPLC的總運行時間為45 min。

梯度洗脫條件:0～15 min,5%～6% A;15～30 min,6%～30% A;30～35 min,30%～45% A;35～45 min,45%～65% A。

1.2.8 抗氧化活性測定

1.2.8.1 鐵還原力(ferric reducing antioxidant potential assay,FRAP)測定 鐵還原力測定采用曠慧等[23]方法進行。

1.2.8.2 清除DPPH·能力測定 清除DPPH·能力測定采用李鑫鑫等[24]方法。取濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的樣液各10 μL，在避光條件下加入140 μL的DPPH儲備溶液(無水乙醇溶解，400 μg/mL)，混勻，避光反應30 min，之后在515 nm處檢測其吸光度，VC作為陽性對照。結果用DPPH自由基的清除率表示，計算公式為：

DPPH·清除率(%)=(1-(A1-A2)/A0)×100

式(1)

式中：A1為樣品的吸光度；A2為樣品的背景值；A0為空白對照組的吸光度值。

1.2.8.3 清除OH·的能力測定 取濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的樣液各0.5 mL,分別加入6 mmol/L硫酸亞鐵和6 mmol/L水楊酸各0.5 mL,充分振蕩搖勻,靜置10 min后加入0.5 mL H2O2,室溫下反應35 min,8000 r/min離心10 min,510 nm下檢測其吸光度,VC為陽性對照。根據式(2)計算OH·清除率。

式(2)

式中:A1為樣品的吸光度;A2為背景的吸光度;A0為空白的吸光度。

式(3)

式中：A1為樣品的吸光度；A2為背景組的吸光度；A0為空白的吸光度。

1.3 數據處理

每個實驗3次重復,數據以平均數±標準偏差顯示,數據采用Excel、SPSS軟件進行分析處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 天麻水提取物的常規理化和營養成分含量

對天麻水提物中的水分、灰分、淀粉、粗蛋白、粗脂肪、總多糖、碳水化合物常規營養成分的含量進行了測定,結果見表1。天麻水提物中蛋白質的含量為9.21 g/100 g,碳水化合物含量高達79.80 g/100 g,脂肪含量僅4.01 g/100 g,符合現代人追求低脂飲食的需求。天麻水提取物中碳水化合物、蛋白質、脂肪等人體必需的七大類營養物質為93 g/100 g,因此天麻水提物具有高營養、低脂肪的特點,具有很好的開發價值。康明等[25]測定了德江天麻中的灰分含量為2.55 g/100 g,灰分含量高于本研究結果。葛進等[26]比較了不同產地的天麻營養成分含量,多糖含量為11.83%～24.46%,粗脂肪為1.09%～2.09%,淀粉10.29%～21.84%,粗蛋白為2.15%～9.27%,與本研究結果相比，其多糖含量和淀粉含量較低。多糖和淀粉在熱水中溶解度較大,而本研究的提取工藝是通過熱水回流提取3次,天麻塊莖中的多糖和淀粉被充分溶解而提取出來,故本研究的天麻水提物中多糖含量和淀粉含量均比葛進等的研究結果高。

表1 天麻水提取物中營養成分Table 1 Nutrient contents of the aqueous extract of Gastrodia elata

2.2 礦物質含量

通過ICP-MS測得10種礦物質含量的結果見表2,由表2可知，天麻中含有豐富的礦物質元素,其中常量元素中鉀元素含量最高,為25477.45 mg/kg,這與李金玲等[27]的研究一致,鉀元素含量最高為25530 mg/kg。其次鈣含量高達2224.71 mg/kg可加工成高鈣食品,用于補充人體所需要的鈣。本研究結果K/Na值為49.90,高鉀低鈉的營養結構對高血壓、高血脂癥患者特別有益[28]。鋅在人體生長發育、免疫、內分泌、生殖遺傳等重要生理過程中起著極其重要的作用,天麻中鋅含量豐富,為45.33 mg/kg;鐵和錳的含量分別為45.10、21.54 mg/kg,這些礦物質元素對機體的造血細胞、免疫系統和中樞神經有非常重要的作用。此外,硒是人體必需的微量元素之一,人體缺硒可患克山病、大骨節病、心臟病、白內障、新生兒溶血性貧血等疾病,但過量的硒可引起硒中毒。天麻水提物中含有少量的硒元素(0.10 mg/kg),郎春燕報道野生天麻中硒元素為1.77 mg/kg,其結果高于本研究結果[29]。2018年4月開始執行的《中國居民膳食營養素參考攝入量》[30]中規定18歲以上者的推薦攝入量為60 μg/d,天麻的成人每天推薦使用量為10～30 g,由此可攝入硒元素。

表2 天麻水提取物中礦物質元素含量Table 2 Contents of mineral elements of the aqueous extract from Gastrodia elata

2.3 氨基酸組成及含量

氨基酸是構建生物機體的眾多生物活性大分子之一,是構建細胞、修復組織的基礎材料。天麻水提物中氨基酸種類及含量豐富(見表3),其中總氨基酸(TAA)的含量為29.090 mg/g,必需氨基酸(EAA)占總氨基酸含量的16.85%。必需氨基酸中纈氨酸的含量最高為0.86 mg/g,其次是蘇氨酸,含量為0.69 mg/g,酪氨酸含量最低,為0.23 mg/g。非必需氨基酸(NEAA)占總氨基酸含量的83.15%,為24.470 mg/g,天冬氨酸含量最高,達7.47 mg/g,精氨酸含量最低,為0.88 mg/g。非必需氨基酸的攝取,對動物與人類的健康、成長、發育、繁殖十分重要。與山藥相比,發現山藥中必需氨基酸中纈氨酸的含量最高,為0.617 mg/g,非必需氨基酸占總氨基酸含量的70.82%。天麻中總氨基酸含量高于淮山藥,氨基酸種類也多于淮山藥,可為天麻的開發利用提供理論依據。

表3 天麻水提取物中氨基酸的組成和含量(mg/g)Table 3 Composition and content of amino acids in Gastrodia elata water extract(mg/g)

2.4 天麻水提物中總多酚、總黃酮和原花青素含量

由表4可知,天麻水提物中總多酚為17.0 mg/g,總黃酮為9.0 mg/g,原花青素含量為3.3 mg/g(見表4)。孟月麗等[31]檢測了鐵棍山藥皮中的總多酚,含量為3.578 mg/g;鄭朝華等[32]測定了西洋參中的總黃酮,含量為1.756 mg/g;紫山藥中的原花青素,含量為2.10 mg/g,天麻水提取物中總多酚、總黃酮和原青花素均高于鐵棍山藥皮總多酚、西洋參總黃酮和紫山藥原花青素,可為天麻作為藥物的研發奠定一定的基礎。

表4 天麻水提取物中總多酚、總黃酮和原花青素含量Table 4 Contents of total polyphenols,total flavonoids and procyanidins in Gastrodia elata water extract

2.5 天麻素和對羥基苯甲醇

通過計算峰面積與樣品質量之間的關系,得到天麻素和對羥基苯甲醇對照品的回歸方程(見表5)。中國藥典(2015版)中規定天麻藥材中天麻素和對羥基苯甲醇的含量大于0.25%,根據回歸方程(表5)測得的天麻水提取物中天麻素和對羥基苯甲醇的總含量為3.51%,符合中國藥典的規定,且總含量較高。天麻中的主要藥理活性成分為天麻素,天麻素易溶于水,本研究中采取熱水回流提取能較好地提取到天麻中的天麻素,該提取物具有藥理活性成分高的特點,可作為添加劑應用在保健食品中。

表5 天麻素和對羥基苯甲醇含量測定Table 5 Determination of gastrodin and p-hydroxybenzyl alcohol

圖1 UPLC測定天麻素和對羥基苯甲醇色譜圖Fig.1 UPLC chromatographic profiles ofgastrodin and hydroxybenzyl alcohol注:(A)對照品圖;(B)天麻水提物；峰1:天麻素;峰2:對羥基苯甲醇。

2.6 多酚組成

利用UPLC測定了14種單體酚,天麻水提物中檢測到了7種多酚(不包括前面已經檢測到的天麻素和對羥基苯甲醇),分別為葒草素、槲皮素、咖啡酸、表兒茶素、兒茶素、肉桂酸、對羥基苯甲酸,其中葒草素含量最高,達161.96 mg/100 g,對羥基苯甲酸最低是(0.70±0.02) mg/100 g,總酚含量為0.291 mg/g,與前面檢測到的總多酚含量相差甚遠,可能是天麻中還含有其他種類多酚且含量甚高,其他多酚種類及含量還有待進一步研究。

2.7 天麻水提物的抗氧化活性

圖2 天麻水提物的抗氧化性Fig.2 Antioxidation of aqueous extract from Gastrodia elata注:.(A)天麻水提物的總還原力;(B)天麻水提物的DPPH·清除能力;(C)天麻水提物的OH·清除能力;(D)天麻水提物的清除能力。

表6 天麻水提取物中多酚組成(mg/100 g干物質)Table 6 Polyphenol composition in Gastrodia elatawater extract(mg/100 g·extract dry weight)

3 結論

本研究檢測了天麻水提物中的營養物質和活性成分,并且評價了其抗氧化活性。天麻中水分、灰分、淀粉、粗蛋白、粗脂肪、總多糖和碳水化合物的含量分別是4.60、1.55、40.30、9.21、4.01、38.24、79.80 g/100 g,礦物質中鉀元素的含量最高,為25477.45 mg/kg;天麻中活性成分總多酚、總黃酮和原青花素分別為17.0 mg/g、9.0 mg/100 g、3.3 mg/g,天麻素和對羥基苯甲醇的含量為2.87%和0.64%;天麻中含有種類豐富的多酚,本研究中檢測到7種多酚,為對羥基苯甲酸、兒茶素、咖啡酸、表兒茶素、葒草素、槲皮素和肉桂酸,其中葒草素的含量最高,為161.96 mg/100 g。隨著天麻提取物濃度的增加,其還原力和對自由基的清除能力均逐漸增強,當天麻水提物濃度為10 mg/mL時,對DPPH·清除率可達90%,接近于陽性對照VC。由此可見,天麻水提物不僅具有較高的營養價值,而且具有一定的抗氧化活性,在未來一定會有很好的開發和應用前景。