黔產薏苡仁油成分分析及對破骨細胞活性的影響

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(1.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025;2.貴州省藥食同源植物資源開發工程技術研究中心,貴州貴陽 550025;3.貴州大學中藥天然藥研發中心,貴州貴陽 550025;4.西南藥食兩用資源開發利用技術國家地方聯合工程研究中心,貴州貴陽 550025;5.貴陽中醫學院藥學院,貴州貴陽 550025)

薏苡仁(Coixlacryma-jobiL.var.mayuen(Roman.)Stapf)為一年或多年生禾本科植物薏苡的種仁,我國大部分地區都有生產,貴州興仁為主產區之一,約占全國薏仁種植面積的80%。興仁薏仁米產于貴州省黔西南州,是國家質檢總局地理標志產品。薏苡仁除藥用外,還常常作為副食品用,故被用作藥食兩用資源[1]。薏苡渾身是寶,已被國內外學者廣泛研究,其主要化學成分為油酯類、糖類、蛋白質類、礦物質及其他[2]。其藥理作用研究表明,薏苡仁具有抗腫瘤[3]、降血糖[4]、抗潰瘍、止瀉[5]、消炎鎮痛[6]、降血脂[7]等功效。

已有研究報道,Yang R S等[8]利用去卵巢抗骨質疏松大鼠模型評估了薏苡仁水提物對骨質疏松癥預防的影響,這一發現提示薏苡仁提取物有著能夠逆轉大鼠骨質疏松狀態的功效,故而薏苡仁具有作為有效預防骨質疏松癥的健康食品的潛力。有相關研究表明薏苡仁種子中含量最多的成分為薏苡仁油[9],故本實驗將對黔產薏苡仁進行薏苡仁油脂的提取并對其進行脂肪酸的GC-MS分析,進一步將不同濃度的黔產薏苡仁油(0.98、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25 μg/mL)作用于1α,25-(OH)2VitD3誘導的原代分離的新西蘭乳兔骨髓細胞[10],以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)+細胞數、TRAP酶活力及骨陷窩面積作為指標,來反映薏苡仁油對抑制破骨細胞分化及骨吸收活力的影響[11],為研究薏苡仁對骨質疏松癥的預防作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黔產薏苡仁 來自中國薏仁米之鄉——興仁縣原產地;新西蘭乳兔(出生48 h以內) 貴陽經濟技術開發區鵬程農業科技有限公司,合格證號:SCXK(黔)2012-001;骨磨片 蘭州軍區蘭州總醫院骨科研究所;α-MEM培養基 美國Gibco公司;胎牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)測試盒 南京建成生物工程研究所;MTT(噻唑藍)、DMSO(二甲基亞砜) 北京索萊寶生物科技有限公司;甲苯胺藍、1α,25-(OH)2VitD3、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒 日本Sigma公司。

HP6890/5975C氣相-質譜聯用儀 美國安捷倫公司;手動固相微萃取裝置、萃取纖維(2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableF-lex) 美國Supelco公司;3110 水套系列CO2恒溫恒濕培養箱、Multiskan FC多功能酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;SJ-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;DMi8-M倒置熒光顯微鏡 Leica Microsystemes CMS GmbH Ernst-Leitz-Str公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黔產薏苡仁油的提取與制備 本研究采用的是無水乙醇超聲輔助法提取黔產薏苡仁油[12]:將成熟自然風干的黔產薏苡仁種子粉碎至物料粒徑為60～80目后,稱取50 g黔產薏苡仁粉末,料液比為(薏苡仁粉末∶無水乙醇)1∶3.5 g/mL,溫度為50 ℃,超聲功率350 W,超聲頻率30 kHz,提取時間40 min,最后得到2.2 g的黔產薏苡仁油。稱取100 mg黔產薏苡仁油,用1 mL DMSO溶解,得濃度為1.0×105μg/mL母液,儲存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 黔產薏苡仁油的脂肪酸殘基GC-MS分析 首先將黔產薏苡仁油甲脂化后,采用微量注射器注入樣品溶液進行GC-MS分析,用標準脂肪酸甲脂作為參照來確定樣品中的脂肪酸成分。GC-MS分析條件:采用FB-5MSI(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱,柱溫為50～309 ℃(每分鐘升溫8 ℃);離子源溫度230 ℃;離子源為EI源;電子能量70 eV。對總離子流圖中的各峰均用質譜計算機數據系統進行分析和處理,同時通過核對Nist2005和Wiley275標準質譜圖,確定了黔產薏苡仁油脂肪酸殘基中的14種揮發性化學成分,各化學成分均使用峰面積歸一化法測定其相對質量分數。

1.2.3 骨髓細胞的分離與培養 將購買來的出生48 h以內的新西蘭乳兔,斷頸處死,用75%乙醇浸泡15 min以上,在超凈工作臺中取出乳兔后肢,浸泡于PBS中,用醫用紗布剝離出股骨,浸泡于含10%血清的α-MEM完全培養基中,用手術剪縱向剪開乳兔股骨,用手術刀輕輕刮下骨髓內細胞,吹打混勻后渦旋30 s,用200目細胞篩過篩,獲得乳兔原代骨髓細胞。根據實驗需求,96孔培養板:將原代骨髓細胞調整細胞濃度至5×105個/mL后接種,48孔培養板:將原代骨髓細胞調整細胞濃度至2×106個/mL后接種。于5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養穩定24 h后,用適量PBS輕輕洗一遍。

1.2.4 對骨髓細胞存活率的影響 用含10%血清的α-MEM完全培養基,采用倍半稀釋法,將黔產薏苡仁油調整為不同濃度(0.06～1000 μg/mL)培養液后加入到接有原代骨髓細胞的96孔培養板中,實驗設置空白組(空白培養液為不含薏苡仁油,含10%血清的α-MEM完全培養基)。之后每2 d更換一次培養液,藥物作用6 d后,換入含10%的5 mg/mL MTT的α-MEM完全培養基,置于37 ℃恒溫培養箱中孵育4 h,用注射器小心吸棄上清液,每孔加入適量DMSO,振蕩10 min,使用多功能酶標儀在波長490 nm處檢測OD值。

1.2.5 實驗分組 分別設置實驗組:含不同濃度黔產薏苡仁油(A:31.25 μg/mL,B:15.63 μg/mL,C:7.81 μg/mL,D:3.91 μg/mL,E:1.95 μg/mL,F:0.98 μg/mL)的10%血清及10-8mol/L 1α,25-(OH)2VitD3的α-MEM完全培養基;陽性對照組G:含10-8mol/L雌二醇的10%血清及10-8mol/L 1α,25-(OH)2VitD3的α-MEM完全培養基;陰性對照組H:含10%血清及10-8mol/L 1α,25-(OH)2VitD3的α-MEM完全培養基。

1.2.6 TRAP染色 將不同的實驗分組加入到接有原代骨髓細胞的48孔培養板中,每隔2 d換一次培養液,藥物連續作用8 d后,吸去上清液,用PBS輕輕洗一遍,用固定液(25%檸檬酸緩沖鹽,10%甲醛,65%丙酮)固定5 min,雙蒸水輕輕洗一遍,將水吸干,加入染液,37 ℃避光孵育1 h,顯微鏡下觀察,拍照,用雙蒸水輕輕洗一遍,用蘇木素復染5 min,流式沖洗返藍,顯微鏡下對TRAP陽性細胞(細胞胞漿內形成紫紅色沉淀、多核)計數、拍照。

1.2.7 TRAP酶活力測定 按照實驗分組將不同濃度藥物加入到接有原代骨髓細胞的48孔培養板中,每隔2 d換一次培養液,藥物作用8 d后,吸去上清液,用PBS輕輕洗一遍,每孔加入適量裂解液(0.2% Tritanx-100),置于37 ℃恒溫培養箱裂解5～10 min,取細胞裂解液按抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒說明書操作。

1.2.8 骨吸收陷窩面積測定 按照實驗分組將不同濃度藥物加入到接有原代骨髓細胞(提前放有6 mm×6 mm大小骨磨片)的48孔培養板中,每隔2 d換一次培養液,藥物作用8 d后,吸去上清液,用PBS輕輕洗一遍,用10%甲醛溶液固定5 min,用雙蒸水輕輕洗一遍,加入0.25 mol/L的氨水超聲5 min,依次采用適量80%、85%、95%無水乙醇梯度洗脫,每次2 min,用0.1%甲苯胺藍溶液染色5 min,最后使用熒光倒置顯微鏡拍照并計算面積。

1.3 統計學分析

所有數據均使用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 黔產薏苡仁油的脂肪酸殘基GC-MS分析

結合GC及GC-MS技術(圖1)確定薏苡仁油的脂肪酸殘基分別為十四烷酸(肉豆蔻酸)、十六烷酸(棕櫚酸)、十八烷酸(硬脂酸)、十八碳一烯酸(油酸)、十八碳二烯酸(亞油酸)、二十二烷酸(山崳酸)、角鯊烯和γ-谷甾醇(見表1、表2),都為碳數12以上的脂肪酸。

圖1 黔產薏苡仁油的總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of Coix seed oil in Guizhou

表1 黔產薏苡仁油的脂肪酸殘基特征碎片離子解析表Table 1 Fatty acid residue characteristic fragment ion analysis table of coix seed oil in Guizhou

表2 黔產薏苡仁油中的脂肪酸殘基有效成分定性分析Table 2 Qualitative analysis of effective components of fatty acid residues in coix seed oil in Guizhou

2.2 對骨髓細胞存活率的影響

原代骨髓細胞培養7 d后,顯微鏡觀察發現,細胞能均勻鋪滿96孔培養板底部,將不同濃度黔產薏苡仁油(0.06～1000 μg/mL)培養液作用于兔原代骨髓細胞6 d后,與空白組相比,細胞存活率隨濃度的升高而不斷降低,當濃度高于31.25 μg/mL時,細胞存活率低于100%(見圖2)。當細胞存活率趨于穩定時(在100%附近)可認為該藥物濃度對該細胞毒性較小,從而排除藥物毒性對實驗的干擾,故選擇0.98、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25 μg/mL作為實驗濃度最為適宜。

圖2 黔產薏苡仁油對骨髓細胞存活率的影響Fig.2 Effect of coix seed oil in Guizhou on survival rate of bone marrow cells

2.3 TRAP染色

通過比較TRAP陽性細胞數目及大小,可以衡量破骨細胞活性大小(表3，圖3)。各濃度組與陰性對照組TRAP陽性細胞計數相比,均具有顯著性(p<0.05),陰性對照組TRAP陽性細胞數目較多,且體積大、核較多,陽性對照組和黔產薏苡仁組TRAP陽性細胞數目均相對較少,且體積小、核少;黔產薏苡仁油不同濃度組的TRAP陽性細胞數隨樣品作用濃度升高而逐漸減少,其中高濃度A組31.25 μg/mL的TRAP陽性細胞數最少,且細胞較小,存在明顯的濃度依賴性。

圖3 TRAP陽性細胞染色Fig.3 TRAP positive cells staining注:A:黔產薏苡仁油31.25 μg/mL組;B:黔產薏苡仁油15.63 μg/mL組;C:黔產薏苡仁油7.81 μg/mL組;D:黔產薏苡仁油3.91 μg/mL組;E:黔產薏苡仁油1.95 μg/mL組;F:黔產薏苡仁油0.98 μg/mL組;G陰性組;H陽性組。表3、圖4、圖5同。

表3 TRAP陽性細胞數及TRAP酶活力的影響Table 3 Effects of TRAP positive cell number

2.4 TRAP酶活力測定

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)在破骨細胞里面是一種特殊的標志性磷酸酶,所以可以用TRAP酶活來衡量破骨細胞活性。由表3可知,與陰性對照組相比,各濃度組均具有顯著性差異(p<0.05),陰性組TRAP酶活力較大,各不同濃度給藥組的TRAP酶活力隨作用濃度的升高而逐漸下降,其中高濃度A組31.25 μg/mL的酶活力明顯較低,且存在明顯的濃度依賴性,與TRAP陽性細胞數結果相一致。

2.5 骨陷窩面積

骨吸收陷窩則是破骨細胞在機體內部進行骨吸收過程的直接結果,因此可以用這一指標來反映破骨細胞的活性。由圖4、圖5可知,與陰性對照組相比,各濃度組均具有顯著性差異(p<0.05),陰性組骨陷窩面積較大,各不同濃度給藥組骨陷窩面積隨作用濃度的升高而逐漸減少,其中高濃度A組31.25 μg/mL的骨陷窩面積明顯較低,且存在明顯的濃度依賴性,與TRAP陽性細胞數及TRAP酶活結果相一致。

圖5 骨膜片染色Fig.5 Periosteum staining

圖4 骨陷窩面積結果Fig.4 Results of bone lacunae

3 討論與結論

在骨吸收、代謝的過程中,主要由成骨細胞負責骨形成,破骨細胞負責骨吸收,而在機體里面為了維持正常的骨量,骨吸收和骨形成一直處于一個動態平衡過程,如果這一平衡被打破將會產生諸多骨病,如骨質疏松、骨硬化等,因此研究藥物對破骨細胞的活性影響可以推測出該藥物是否對骨質疏松癥具有一定的預防和治療作用[13]。而抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)在破骨細胞里面是一種特殊的標志性磷酸酶,所以通常把TRAP酶活作為衡量破骨細胞活性的一個重要標志[14];骨吸收陷窩則是破骨細胞在機體內部進行骨吸收過程的直接結果,因此也可以用這一指標來反映破骨細胞的活性。

本實驗首先通過無水乙醇超聲輔助法對黔產薏苡仁油進行提取,并對其成分進行GC-MS分析,脂肪酸殘基GC-MS分析得出黔產薏苡仁油的脂肪酸殘基主要為十四烷酸(肉豆蔻酸)、十六烷酸(棕櫚酸)、十八烷酸(硬脂酸)、十八碳一烯酸(油酸)、十八碳二烯酸(亞油酸)、二十二烷酸(山崳酸)、角鯊烯和γ-谷甾醇;亞油酸是一種必需脂肪酸,在黔產薏苡仁油中的含量超過31.793%,具有增強機體免疫力、促進骨組織代謝和抗腫瘤等作用[15];油酸則是黔產薏苡仁油中最主要的不飽和脂肪酸,具有良好的抗炎、抗氧化性[16];角鯊烯具有增強機體免疫能力、抗炎、抗氧化及抗腫瘤等生理活性[17];相關研究表明,破骨細胞的活化有兩條通路:主要通路是RANKL/RANK/NF-κB或JNK通路;次要通路是IL-1、TNF-α等炎癥因子激活的非RANKL/RANK依賴通路,兩者是相互聯系的,炎癥都參與激活破骨細胞分化的兩條通路,而破骨細胞又是骨吸收過程中的最終作用細胞,因此炎癥的產生可以通過增加破骨細胞的活性,來使其在骨吸收中發揮重要作用[18]。在進一步的黔產薏苡仁油對破骨細胞活性影響實驗中,TRAP染色、TRAP 酶活力分析和骨吸收陷窩面積的結果均表明,黔產薏苡仁油能顯著抑制破骨細胞的活性。在本實驗的研究中,黔產薏苡仁油抑制破骨細胞活性的影響均呈現良好劑量依賴性,高濃度組對破骨細胞活性的抑制作用較強,該抑制作用隨著藥物濃度的降低而不斷減弱,其中高濃度劑量A組31.25 μg/mL的抑制作用最為顯著(p<0.05)。

由實驗結果可以推測,黔產薏苡仁油對骨質疏松具有一定的預防和治療作用,這種作用可能是通過抑制破骨細胞活性來實現的。本實驗為進一步研究薏苡仁對骨質疏松癥的預防作用奠定了基礎,而薏苡仁油在調節骨吸收和代謝平衡中的作用及其機制,還有待于更進一步的研究。