牦牛酸奶酪中高產乳糖酶菌株分離鑒定及其酶學性質

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(1.泰山醫學院生命科學學院,山東泰安 271016;2.山東農業大學生命科學學院,山東省農業微生物重點實驗室,山東泰安 271018)

乳糖酶(lactase)又稱β-半乳糖苷酶(β-galactosidase),具有催化β-半乳糖苷鍵水解,使乳糖轉化為半乳糖和葡萄糖的功能,廣泛應用于醫藥、食品和環保等方面[1-2]。醫藥方面,乳糖酶主要用于治療乳糖不耐癥[3]。食品工業方面,乳糖酶可用于生產低乳糖制品和低聚半乳糖[4]。低乳糖乳制品可供乳糖不耐受人群食用;而低聚半乳糖是很好的益生元,它難以被人體吸收,但能被腸道內雙歧桿菌所利用,還具有糖類的共有屬性和較好的口感,能夠改善腸道菌群、增強免疫系統,被廣泛用于制作高血脂、肥胖、糖尿病人的無熱量食品[5]。環境保護方面,乳清是生產干酪和干酪素的副產品,含有乳糖、維生素和乳清蛋白等營養成分,每年世界上約產乳清 9×107噸,其中50%當廢水排放,不僅造成浪費,而且污染環境[6]。利用乳糖酶可將乳清中的乳糖分解為葡萄糖和半乳糖,用以制造乳清糖漿或作為添加劑添加到食品中,從而達到綜合開發利用乳清資源,減少環境污染的目的[7]。

乳糖酶的來源豐富,包括動物來源和微生物來源。微生物具有生長繁殖快、產量高的優點,在實際應用時一般從微生物中得到,主要包括產乳糖酶細菌、酵母菌和霉菌[8]。不同來源的微生物乳糖酶性質也不同,細菌和酵母所產乳糖酶最適pH近中性,適用于牛乳的水解;霉菌所產的乳糖酶最適pH偏酸性,適用于干酪與酸性乳清的水解[9]。然而天然微生物的乳糖酶產量低,為提高乳糖酶產量,使其能更好地應用于工業生產,國內外開展了關于菌株誘變育種、發酵條件優化以及基因重組等研究[10-14]。這些研究工作的進行,都應以產量較高、性能穩定的原始菌株為基礎,故而乳糖酶高產菌株的篩選工作依然重要。

我國西部牧區主要包括新疆、青海、甘肅、西藏等牧區,因其具有低溫、高海拔、高輻射、寡營養等特殊條件,造就了該區豐富獨特的菌種資源[15]。牧民采用傳統方法制作乳制品過程中,伴隨著大量微生物的生長代謝活動[16]。目前針對乳制品中菌種資源的開發,主要是對其中所蘊含的微生物進行分離鑒定及多樣性分析[17-22],而從中篩選高產乳糖酶菌株的報道很少。僅巨蕾等人從甘南牧區牦牛乳酸奶中篩選到產乳糖酶的腸桿菌屬Enterobactersp.SYA2,并研究了該菌株的產酶條件[23]。本研究擬從采集自西藏牧區的牦牛奶酪中篩選高產乳糖酶菌株,同時研究乳糖酶的酶學特性,為進一步開發利用產乳糖酶微生物資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸奶酪 購買自藏區牧民自制10份,分裝于10個無菌保鮮袋中并編號,置于冰盒中帶回實驗室,放在4 ℃冰箱中保存；鄰硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG,色譜純)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal) 北京索萊寶科技有限公司;鄰硝基苯酚(ONP,分析純) 乳糖阿拉丁試劑有限公司。

初篩培養基:乳糖20 g,酵母膏10 g,蛋白胨10 g,X-gal 0.04 g,水1000 mL,瓊脂20 g,pH7.0。發酵培養基:乳糖15 g,蛋白陳20 g,酵母膏3 g,NaCl 3 g,K2HPO41 g,MnCl20.1 g,水1000 mL,pH7.0。牛肉膏蛋白胨培養基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g、NaCl 5 g,瓊脂20 g,水1000 mL,pH7.0～7.2。磷酸鹽緩沖液(pH6.5):磷酸二氫鉀0.68 g,加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液15.2 mL,用蒸餾水稀釋至100 mL。

SW-CJ-2FD型超凈工作臺、SPX-250B5H-Ⅱ型生化培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;ZQLY-180S型振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司;3-30K型低溫高速離心機 Sigma公司;HVE-50型高溫滅菌鍋 上海精宏實驗設備有限公司;DK-8D型電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司;UV757CRT型紫外可見分光光度計 上海棱光技術有限公司;超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物技術有限公司。

1.2 菌種初篩

稱量1 g樣品加入到滅菌的研缽中,用杵研碎后加入到9 mL的無菌水中,將體積分數從10-1依次稀釋到10-7,選擇10-3～10-7五個梯度濃度的樣品稀釋液,涂布于含有0.04 g/L X-gal的初篩培養基上,37 ℃下培養24 h,選取變藍的菌落分純后編號,接入發酵培養基中以備復篩。編號方法為:在樣品編號后面直接編號。如RTM-111即為從RTM-1號奶酪樣品中分到的11號菌落。

1.3 菌種復篩

將初篩得到的菌株接種于發酵培養基中,37 ℃、150 r/min振蕩培養24 h,取培養液20 mL。4 ℃、6000 r/min離心15 min,收集菌體沉淀并用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.5)洗滌兩次,加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.5)至20 mL,超聲破碎15 min,4 ℃、12000 r/min離心15 min,取上清液即為乳糖酶粗酶液,通過測定酶活以進行菌種復篩。

1.4 乳糖酶活力的測定及標準曲線的繪制

1.4.1 乳糖酶活力測定 參照參考文獻[23],以ONPG為酶作用底物,取0.5 mL酶液,37 ℃下水浴5 min,加入已預熱至37 ℃的含5 mmol/L ONPG磷酸鹽緩沖液(pH6.5)1.5 mL,37 ℃下水浴反應10 min,然后立即加入3 mL 0.5 mol/L Na2CO3終止反應,于420 nm下測定OD值,測定3次取平均值。以加熱失活的酶液或蒸餾水作為空白。一個酶活力單位定義(U)為:在37 ℃每分鐘水解釋放1 μmoL ONP所需的酶量。

X=(C×5×N)/(0.5×10)

其中,X為乳糖酶活力;C為標準曲線上對應的ONP濃度;N為稀釋倍數。

1.4.2 標準曲線繪制 取6支試管分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L的ONP溶液。以第一只試管為空白,測OD420。以ONP濃度為縱坐標,OD420為橫坐標繪制標準曲線。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 菌體形態觀察 用革蘭氏染色法將細胞染色后觀察細菌個體形態。用已知菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)同時染色做為對照。

1.5.2 生理生化反應特征 生理生化特性測定參照《常見細菌系統鑒定手冊》中的方法[24]。

1.5.3 分離菌株的16S rDNA鑒定 16S rDNA序列測定及系統發育分析采用細菌16S rDNA通用引物:27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACCT-3′)進行PCR擴增。PCR反應采用50 μL體系。反應條件:94 ℃,5 min;94 ℃,45 s;55 ℃,45 s;72 ℃,2 min,30個循環;72 ℃,10 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收,目的片斷交由睿博興科(青島)測序部進行測序。將測定的16S rDNA序列與GenBank中已知核酸序列進行BLSAT分析,從中獲得與菌株16S rDNA 同源的序列,利用MEGA7.0 軟件構建系統發育樹。

1.6 乳糖酶酶學性能

1.6.1 最適反應溫度與熱穩定性 最適反應溫度:取1 mL磷酸鹽緩沖液(pH6.5)稀釋的酶液,分別于30、40、50、60、70 ℃保溫5 min,同時另將1 mL ONPG溶液依次在相同溫度下預熱5 min。將ONPG加入到相應溫度的酶液中反應10 min,隨后加入3 mL Na2CO3終止反應。計算各溫度下的相對酶活(即各酶活與最高酶活的百分比),確定酶的最適反應溫度。

酶的熱穩定性:取1 mL磷酸鹽緩沖液稀釋的酶液,于40、50、60、65 ℃保溫0、10、20、30、40、50 min,同時將1 mL ONPG溶液依次在相同溫度下進行保溫。將ONPG加入到粗酶液中,37 ℃反應10 min,加入3 mL Na2CO3終止反應,測OD420,以65 ℃加熱失活的酶液作為空白對照,以0 min酶活為100%,計算相對酶活,測定酶的熱穩定性。

1.6.2 最適pH和pH穩定性 最適pH:在最適溫度條件下,按1.6.1項下方法,測定pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0條件下酶活性。計算各pH酶活與最高酶活的百分比,確定酶最適反應pH。

pH穩定性:將酶液分別置于pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0的緩沖溶液中,37 ℃處理18 h,測定不同pH條件下的酶活,以最高酶活為100%,計算各pH酶活與最高酶活百分比,測定酶的pH穩定性[25-26]。

1.6.3 金屬離子和EDTA對酶活的影響 在酶促反應體系磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中分別加入1 mol/L的Na+、K+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+和EDTA溶液,使最終反應體系中金屬離子的濃度均為1 mmol/L,測定酶活力。以不加金屬離子溶液的酶活為空白對照,酶活力為100%,計算各離子存在時的相對酶活。

相對酶活(%)=各離子存在時的酶活/空白對照的酶活×100

1.7 菌株產酶穩定性

將產乳糖酶菌株接種到斜面上連續傳代培養5代,每代均接種到液體發酵培養基中進行培養,并按照1.6.1項下方法進行酶活測定,測定各代的乳糖酶活力。

1.8 數據處理

利用Excel 2010及SPSS 20.0對試驗數據進行處理及分析。

2 結果與分析

2.1 菌種初篩

經過挑選,從10個樣品中共分離得到10株產乳糖酶菌株。菌株在初篩培養基上的菌落顏色變化情況見表1。

表1 產酶菌株菌落變色情況Table 1 Bacterial colony discoloration of enzyme producing strain

由表1可知,10株產乳糖酶菌株在初篩培養基上有3株菌落藍色深,4株藍色較深,3株藍色較淺。將10株菌株接種到發酵培養基進行復篩。

2.2 菌種復篩

2.2.1 ONPG標準曲線 以吸光度OD420為橫坐標,ONP濃度為縱坐標繪制乳糖酶活性標準曲線,相關系數R2=0.998(圖1),說明該標準曲線可用于乳糖酶的測定。

圖1 乳糖酶活性測定標準曲線Fig.1 Standard curve of lactase activity

2.2.2 產乳糖酶菌株的酶活 上述10株菌株接種于發酵培養基培養24 h后,以吸光度最低的菌株OD值0.9為標準,把各菌株培養液的OD600調節為0.9,然后利用1.3項下的方法制備粗酶液,按1.5.1項下測定酶活。各菌株酶活復篩結果如表2所示,酶活力高于3.00 U/mL的菌株有3株,低于3.00 U/mL高于1.00 U/mL的菌株有2株,低于1.00 U/mL的菌株有5株。菌株RTM-111的酶活顯著高于其他菌株(p<0.05),為18.07 U/mL。近年來關于產乳糖酶細菌的報道,酶活一般在10 U/mL以下[23,25-28],Venkateswarulu等[29]報道的產乳糖酶的枯草芽孢桿菌,經條件優化后,酶活可達到15.27 U/mL。由此可見,RTM-111具有較強的產酶活力,對其進行鑒定并進行后續研究。

表2 不同菌株產乳糖酶的活力Table 2 Activity of lactase in different strains

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態特征 菌株RTM-111在牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落邊緣不規則、微黃色、表面粗糙不透明、有許多褶皺。革蘭氏染色為陽性,有芽孢(如圖2所示)。

圖2 菌株RTM-111革蘭氏染色照片(100×)Fig.2 Gram stain of strain RTM-111(100×)

2.3.2 生理生化反應 生理生化反應結果表明,RTM-111菌株V-P實驗陽性,接觸酶陽性,能水解酪素、淀粉和明膠,能發酵葡萄糖產酸,可發酵甘露醇、木糖、阿拉伯糖,能利用檸檬酸鹽,不能利用丙酸鹽,卵黃反應和吲哚產生實驗陰性,硝酸鹽還原實驗陽性。菌株RTM-111生長特征和生理生化特性與枯草芽孢桿菌的特征吻合[24]。

表3 菌株RTM-111生理生化特征Table 3 Biological and physiological characteristics of strain RTM-111

2.3.3 16S rDNA序列測定及同源性分析 序列測定結果如圖4所示,結果表明,RTM-111菌株 16SrDNA 序列全長1424 bp,其電泳結果如圖3所示。將該序列進行BLAST比對分析,結果發現其與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)同源性最高,達99%。選出相關性較高的芽孢桿菌屬內相關菌株的16S rDNA序列,用MEGA7.0構建系統發育樹,結果顯示其與Bacillussubtilis聚為一族(圖4)。結合理化反應特征及分子鑒定結果,確定RTM-111為枯草芽孢桿菌,命名為BacillussubtilisRTM-111?？莶菅挎邨U菌是一種重要的益生菌,是美國FDA及我國衛生部都認定的安全菌種[30],已被廣泛應用于農業、工業、食品、醫藥、衛生、水產、畜牧業及科研等諸多領域[31-33],因此食源性RTM-111可保證乳糖酶的安全性。

圖3 RTM-111菌株16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarosegel electrophoresis of 16S rDNA from RTM-111

圖4 RTM-111與相關菌株系統進化樹Fig.4 Evolutionary tree of RTM-111 and related strains

2.4 乳糖酶酶學性能研究

2.4.1 最適反應溫度與熱穩定性 酶的最適反應溫度是酶的重要性能,工業生產中一般要求乳糖酶的最適溫度達37 ℃或更高[34]。以橫坐標為溫度,縱坐標為相對酶活繪圖,反應溫度對RTM-111菌產生的乳糖酶活力的影響如圖5所示。結果表明,酶活性隨溫度升高而先增加后減少,40 ℃酶活上升到較高水平(最高值的86.8%),50 ℃酶活最高(21.52 U/mL),60 ℃之后酶活快速下降,至70 ℃相對酶活已降至10%以下。由此可以確定菌株RTM-111乳糖酶的最適溫度為50 ℃。

圖5 反應溫度對RTM-111菌產生的乳糖酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on activity of lactase produced by RTM-111

乳糖酶熱穩定性實驗如圖6所示,結果表明乳糖酶在40 ℃和50 ℃穩定性好,保溫40 min,相對酶活仍保持在80%以上,說明該酶在最適酶活溫度下具有良好的穩定性,具有潛在的應用價值。在60 ℃及以上溫度,酶的穩定性急劇下降,保溫至30 min時酶活下降到10%以下,說明該酶不耐高溫。

圖6 乳糖酶的熱穩定性Fig.6 Thermal stability of lactase

2.4.2 最適pH和pH穩定性 最適pH結果如圖7所示,RTM-111菌株所得酶液在酸性條件下酶活較低,隨pH的增加活性逐漸增強,在pH7.5時達最高值,最后活性逐漸減弱,由此確定該酶的最適pH為7.5。乳糖酶最適pH決定了其用途不同,霉菌產生的乳糖酶最適pH偏酸性(pH2.5～5.0),可應用于酸性乳清和奶酪的水解;而酵母菌和細菌所產乳糖酶最適pH近中性(分別為pH6～7和pH6.5～7.5),適于牛乳和鮮乳清的水解[9,35-36]。該結果說明RTM-111在乳制品水解領域具有應用價值。

圖7 pH對RTM-111菌產生的乳糖酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on activity of lactase produced by RTM-111

乳糖酶的pH穩定性結果表明,在pH6.5～8.0范圍內,維持18 h,乳糖酶酶活性較高(86.7%～100%),說明該酶在最適pH條件下具有較高的穩定性,具有潛在的應用價值(圖8)。

圖8 酶的pH穩定性Fig.8 pH stability of the enzyme

2.4.3 金屬離子和EDTA對酶活的影響 金屬離子會對酶活產生激活或抑制作用,如圖9所示,Na+、Mg2+和Mn2+對酶活有較明顯激活作用,K+、Ca2+對酶活無明顯作用,Cu2+和Zn2+對酶活具有顯著抑制作用,EDTA對乳糖酶活具有完全抑制作用。Rahim等研究嗜冷枯草芽孢桿菌所產生的乳糖酶發現,Na+和K+對酶有激活作用,Ca2+有部分抑制作用,Cu2+和Zn2+有完全抑制作用[37]。而Lara等獲得的枯草芽孢桿菌產生的乳糖酶,能夠明顯被Cu2+和Zn2+所抑制,而對Mg2+、Mn2+和Ca2+不敏感[38]。這些與我們所研究的乳糖酶有區別,說明即使來源于同種不同株的微生物所產生的乳糖酶,其酶學性質也會有區別。上述結果可作為酶活性調節與控制的理論依據。

圖9 金屬離子和EDTA對乳糖酶活力的影響Fig.9 Effect of metalic ions and EDTA on enzyme activity

2.5 菌株產酶穩定性

枯草芽孢桿菌RTM-111每代產乳糖酶結果如表4所示,傳代培養5次,酶活變化幅度很小,差異不顯著(p>0.05),說明該菌株產酶能力穩定。

表4 RTM-111菌株產酶穩定性Table 4 Stability of RTM-111 for enzyme production

3 結論

本實驗從藏區牦牛奶酪制品中分離篩選出得到一株高產乳糖酶菌株RTM-111,綜合形態學、理化反應特征及16S rDNA序列分析,將其鑒定為枯草芽孢桿菌。對RTM-111所產酶的酶學性質研究表明,該酶最適反應溫度為50 ℃,且在 40～50 ℃具有很強的穩定性,說明其在高酶活區能夠保持穩定的性能,具備良好的生產潛力。該酶的最適pH為7.5,在pH6.5～8.0條件下穩定性較高,適于牛乳和乳清的水解。金屬離子對酶活的研究表明,Na+、Mg2+和Mn2+對酶活性具有較強的激活作用,使用時可適當添加以作為酶的激活劑;而Cu2+、Zn2+和EDTA對酶活有顯著的抑制作用,使用時應控制這些離子的濃度。且連續傳代培養后,枯草芽孢桿菌RTM-111產酶能力穩定。總之,本研究所得枯草芽孢桿菌RTM-111所產乳糖酶與以往枯草芽孢桿菌乳糖酶性質不同,具有新穎性且具有較好的應用潛力,為進一步開發利用乳糖酶提供了理論依據。