苯乳酸對(duì)單增李斯特菌的細(xì)胞膜完整性和通透性的影響

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(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121000)

苯乳酸(Phenyllactic acid,PLA),即2-羥基-3-苯基丙酸,結(jié)構(gòu)式如圖1,第二個(gè)碳原子為手性碳原子,因此有兩種對(duì)映異構(gòu)體,即D-PLA和L-PLA[1]。苯乳酸具有很好的親水性,能夠在各種食品體系中均勻擴(kuò)散;苯乳酸有良好的穩(wěn)定性和安全性[2-4],可以從多種乳酸菌發(fā)酵食品中得到[5-6]。乳酸菌是世界公認(rèn)安全(General recognized as safe,GRAS)的微生物,千百年來作為益生菌,廣泛應(yīng)用于發(fā)酵、保藏和開發(fā)新產(chǎn)品。鑒于苯乳酸的天然優(yōu)勢(shì),它被認(rèn)為是繼乳酸菌產(chǎn)生的第一代抑菌物質(zhì)如乳酸、醋酸,第二代抑菌物質(zhì)如nisin等細(xì)菌素以外的新的潛在天然防腐劑[7]。

圖1 苯乳酸的對(duì)應(yīng)異構(gòu)體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Corresponding isomers of phenyllactic acid

抑菌物質(zhì)的抑菌機(jī)理主要有三種:作用于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜系統(tǒng);作用于細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)或者功能蛋白;作用在遺傳物質(zhì)或者遺傳微粒結(jié)構(gòu)[8]。作為一種新型生物防腐劑,關(guān)于苯乳酸抑菌機(jī)理的研究報(bào)道很少。1998年,Dieulevenx用掃描電鏡觀察苯乳酸作用前后L.monocytogenes的超微結(jié)構(gòu),首次報(bào)道其作用機(jī)理[9]。2005年,Str?m等[10]采用雙向電泳(Two-dimensional electrophoresis,2D-PAGE)法,探究苯乳酸對(duì)食品中絲狀真菌(Aspergillus)蛋白質(zhì)組學(xué)的干擾作用,結(jié)果表明苯乳酸可改變細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)的表達(dá),Str?m猜測(cè)苯乳酸作用于真菌細(xì)胞中的苯丙氨酸脫氫酶。2009年,孟祥晨等[11]發(fā)表了國內(nèi)首篇初探苯乳酸的抑菌機(jī)理的相關(guān)報(bào)道,使用掃描電鏡(Scanning electron microscope,SEM)和透射電鏡(Transmission electron microscope,TEM)觀察了苯乳酸作用于指示菌前后的超微觀結(jié)構(gòu)的變化,研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜可能都是苯乳酸的作用位點(diǎn)。

細(xì)胞膜作為細(xì)菌能量傳遞和運(yùn)輸?shù)钠琳?具有重要的生理功能,它既能使單個(gè)細(xì)胞環(huán)境保證胞內(nèi)的穩(wěn)定代謝,又能調(diào)控物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外的進(jìn)出和交換,因此對(duì)細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境和競(jìng)爭(zhēng)性生存具有重要意義,也成為了抑菌物質(zhì)主要的作用靶位之一。近年來,研究學(xué)者發(fā)現(xiàn),抑菌物質(zhì)通過細(xì)胞膜的蛋白凝聚、活性喪失,形成離子通道,破壞細(xì)胞膜的完整性,引起膜通透性改變,最后導(dǎo)致細(xì)菌瓦解死亡,即細(xì)胞膜損傷機(jī)理[12]。目前,對(duì)苯乳酸作用于食源性致病菌的細(xì)胞膜損傷機(jī)理國內(nèi)報(bào)道較少,本文通過研究苯乳酸對(duì)L.monocytogenes10403s的細(xì)胞膜的通透性和完整性作用機(jī)制,探討了苯乳酸的細(xì)胞膜損傷機(jī)理,為苯乳酸的天然防腐抑菌效果提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯乳酸(D-PLA) Sigma公司,純度≥99%;L.monocytogenes10403s 由河北科技大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實(shí)驗(yàn)室保藏;異硫氰酸酯(Fluoresceine isothiocyanate,FITC) Sigma公司,純度≥99%;碘化丙啶(Propidium iodide,PI) Sigma公司購置,純度≥99%;其他所用化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純;含0.6%酵母浸粉的胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(Trypticase soy broth-yeast extract,TSB-YE):胰酪蛋白胨17 g,大豆蛋白胨3 g,葡萄糖2.5 g,磷酸氫二鉀2.5 g,氯化鈉5 g,酵母浸粉6 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃高壓滅菌20 min。

EL204分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;PHS-3C pH計(jì) 上海精密儀器有限公司;Evolution 220紫外分光光度計(jì) 美國Thermo公司;流式細(xì)胞儀Accuri C6 Becton Dickinson公司;LABDANCERS25旋渦混合器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司;F-7000-FL220熒光分光光度計(jì) 日本日立公司;Imager.M2熒光顯微鏡 蔡司公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苯乳酸對(duì)L.monocytogenes10403s最小抑菌濃度的測(cè)定

1.2.1.1 對(duì)數(shù)生長期的L.monocytogenes10403s菌菌液的制備 對(duì)數(shù)生長期的單增李斯特菌的制備[13]:250 mL量程的三角瓶中加入50 mL的TSB培養(yǎng)基,接種量為1%,在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,37 ℃,200 r/min轉(zhuǎn)速,培養(yǎng)6 h,L.monocytogenes10403s菌生長達(dá)到對(duì)數(shù)期,采用培養(yǎng)基為空白對(duì)照,分光光度計(jì)下,用培養(yǎng)基稀釋菌液得到OD值為0.1的菌液,此時(shí)菌液濃度為1×108CFU/mL,培養(yǎng)基稀釋100倍,得到1.0×106CFU/mL的菌懸液。

1.2.1.2 苯乳酸對(duì)L.monocytogenes10403s最小抑菌濃度的測(cè)定 采用液體培養(yǎng)法[13]對(duì)苯乳酸作用于L.monocytogenes10403s的MIC值進(jìn)行測(cè)定。將生長對(duì)數(shù)期的菌液調(diào)到1×106CFU/mL,在96孔板中滴加200 μL菌液,同時(shí)添加梯度稀釋的苯乳酸培養(yǎng)基溶液(32、16、8、4、2、1、0.5 mg/mL)200 μL,等體積混合均勻,每個(gè)梯度做三個(gè)平行,放入培養(yǎng)箱,培養(yǎng)溫度37 ℃,培養(yǎng)24 h,觀察菌液的渾濁程度,渾濁與清晰的界限即為苯乳酸對(duì)L.monocytogenes10403s的最小抑菌濃度。

1.2.2 苯乳酸對(duì)L.monocytogenes10403s細(xì)胞膜通透性影響的測(cè)定 取對(duì)數(shù)期的L.monocytogenes10403s菌液5 mL,調(diào)菌液濃度為1.0×106CFU/mL,將苯乳酸(2MIC)與上述菌溶液等體積混合,在37 ℃下相互作用1 h。然后在上述苯乳酸-菌液混合液中繼續(xù)放入6 μg/mL的FITC試劑100 μL在4 ℃下充分染色20 min后,采用轉(zhuǎn)速為4000 r/min,離心機(jī)離心5 min,棄去上清,沉淀的菌體用PBS緩沖液(pH7.4)8000 r/min,2 min,清洗兩遍,用流式細(xì)胞儀專用進(jìn)樣液50 μL懸浮菌體,流式細(xì)胞儀(AccuriC6)FL1通道(FITC在488 nm下發(fā)射綠色熒光(FL1))測(cè)定細(xì)胞膜通透性變化。每份懸液檢測(cè)5000個(gè)細(xì)胞。數(shù)據(jù)采集后用流式細(xì)胞儀自帶的CellQuestPro軟件進(jìn)行分析[14-15]。

1.2.3 單增李斯特菌L.monocytogenes10403s細(xì)胞膜完整性的測(cè)定

1.2.3.1 流式細(xì)胞術(shù)法對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響 取對(duì)數(shù)期的L.monocytogenes10403s菌液5 mL,且菌液濃度為1.0×106CFU/mL,與苯乳酸(2MIC)等體積混合,作用分別為0、15、30、45、60 min后的L.monocytogenes10403s與10 μg/mL的PI在4 ℃下充分染色20 min,采用轉(zhuǎn)速為4000 r/min,離心機(jī)離心5 min,棄去上清,沉淀的菌體用PBS緩沖液(pH7.4)8000 r/min,2 min,清洗兩遍,采用流式細(xì)胞儀(AccuriC6)FL2通道(PI標(biāo)記細(xì)胞在546 nm發(fā)射紅色熒光(FL2))測(cè)定苯乳酸對(duì)L.monocytogenes10403s細(xì)胞膜完整性影響。

1.2.3.2 熒光顯微鏡法對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響 參考Hong等[16]的試驗(yàn)方法,利用PI的熒光特性研究苯乳酸對(duì)L.monocytogenes10403s細(xì)胞膜完整性的作用。取對(duì)數(shù)生長期的菌液,離心(8000 r/min,5 min),放入800 μL磷酸緩沖液(0.02 mmol/L,pH7.4)懸浮菌液,離心(8000 r/min,2 min),重復(fù)兩次,清洗菌液,用磷酸緩沖液懸浮得到紫外分光光度值為0.4的菌體溶液,取15個(gè)1 mL量程的離心管,分別裝200 μL的菌液,分成A、B試驗(yàn)組:A組中每管加入200 μL磷酸緩沖液(陰性對(duì)照);B組中每管加入200 μL 磷酸緩沖液溶解的PLA,保持終濃度為MIC,作用溫度為37 ℃,作用時(shí)間為1 h后,分別在A、B組中加入PI溶液(終濃度10 μg/mL),在4 ℃低溫沾染20 min,離心(4000 r/min、10 min),棄去上清,沉淀的菌體用PBS緩沖液(pH7.4)懸浮,繼續(xù)采用8000 r/min,2 min離心,反復(fù)兩次清洗雜質(zhì),最后將菌體懸浮于200 μL磷酸緩沖液中。

制片:取10 μL上述B組試驗(yàn)組菌液滴在載玻片上,室溫半干后蓋上蓋玻片,熒光顯微鏡下觀察。分別得到白光、相位對(duì)比圖(phase-contrast)、546 nm激發(fā)下的圖像。

1.2.4 苯乳酸對(duì)細(xì)菌作用后的微觀結(jié)構(gòu)觀察 參考周圍等[18]的實(shí)驗(yàn)方法,取對(duì)數(shù)生長期的菌液,收集菌體用磷酸緩沖液(0.02 mmol/L,pH7.4)清洗后重懸為1.0×106CFU/mL的菌懸液。苯乳酸(2MIC)與菌體等體積混合,分成3組,分別作用1、3、6 h后收集菌體:2000 r/min,低溫離心5 min;用磷酸緩沖液(2 mmol/L,pH7.4)洗三次菌體后,用2.5%的戊二醛固定12 h;將菌體用乙醇梯度(30%、50%、70%、85%、90%、100%)洗二次;用乙酸異戊酯置換乙醇2次;梯度冷凍(4、-20、-80 ℃)后冷凍干燥4 h后,掃描電子顯微鏡觀察苯乳酸作用后的微觀結(jié)構(gòu)變化,對(duì)照組用磷酸緩沖液代替。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每份樣品重復(fù)測(cè)定3次,取其平均值。以ZEN顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)圖像進(jìn)行分析;CellQuestPro對(duì)流式細(xì)胞圖像進(jìn)行分析;以O(shè)rigin 8.0作圖軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯乳酸對(duì)L. monocytogenes 10403s最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)選取PLA培養(yǎng)基溶液7個(gè)濃度梯度為16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL,與單增李斯特菌液在37 ℃下作用24 h后,發(fā)現(xiàn)在2～4 mg/mL之間有明顯的溶液渾濁與清晰的界限,從而得到苯乳酸的最小抑菌(MIC)濃度為2 mg/mL。后續(xù)試驗(yàn)全部采用終濃度為最小抑菌濃度的PLA溶液,來完成其對(duì)單增李斯特菌的細(xì)胞膜完整性和通透性影響的研究。

2.2 苯乳酸對(duì)L. monocytogenes 10403s細(xì)胞膜通透性的影響

FITC是一個(gè)小分子(389.4 Da)熒光標(biāo)記物,只有當(dāng)細(xì)胞膜通透性改變時(shí),才能發(fā)出上綠色熒光[20]。采用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡分析,用FITC標(biāo)記,在488 nm波長激發(fā)下測(cè)定苯乳酸對(duì)L.monocytogenes10403s的細(xì)胞通透性影響,通過流式細(xì)胞術(shù)分析苯乳酸對(duì)L.monocytogenes10403s的細(xì)胞膜通透率為90.60%±0.1%,對(duì)照組通透率為0.05%±0.03%。

如圖2所示,從熒光顯微鏡100倍油鏡觀察大部分細(xì)胞顯示綠色熒光,即被FITC沾染,又由于FITC只有在細(xì)胞膜通透性改變了才能發(fā)出綠色熒光,圖2A是白光下的空白對(duì)照?qǐng)D;圖2B和疊加圖2D與對(duì)照組圖2C完全無綠色熒光,相比得到PLA改變了L.monocytogenes10403s的膜通透性。

圖2 苯乳酸與L. monocytogenes 10403s作用后的FITC通道熒光顯微鏡圖Fig.2 Fluorescence microscopic images of Listeria monocytogenes 10403s cells treated with PLA(MIC)and stained with FITC注:A為白光下的陰性對(duì)照;B為實(shí)驗(yàn)組FITC通道的熒光圖;C為空白組FITC通道的熒光圖;D為A和B的合并圖。

2.3 苯乳酸對(duì)L. monocytogenes 10403s細(xì)胞膜完整性的影響

2.3.1 以PI作為探針用流式細(xì)胞分析苯乳酸對(duì)膜完整性的影響 苯乳酸與L.monocytogenes10403s的結(jié)果見表1和圖3,從表1中發(fā)現(xiàn)隨著苯乳酸作用時(shí)間的增加,膜完整性破壞的程度也在逐漸增加,如苯乳酸作用時(shí)間為15 min時(shí),PI沾染率為17.9%±0.41%,苯乳酸作用時(shí)間30 min時(shí),達(dá)到27.1%±0.35%,45 min達(dá)到58.2%±0.54%,60 min時(shí),達(dá)到最高值91.9%±0.1%。圖3流式分析圖中,橫坐標(biāo)為第二通道的熒光強(qiáng)度,縱坐標(biāo)為相對(duì)細(xì)胞數(shù),V3-L和V3-R分別表示完整細(xì)胞和沾染細(xì)胞所占總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。圖3A為未用苯乳酸作用的流式分析圖,表明百分之百為陰性,未被PI沾染(V3-L 為100%,V3-R為0%),菌體所在的物理分布(前散射圖3A下方圖);圖3B中,作用30 min,PI沾染率發(fā)生變化,陽性菌占到27.1%(V3-L),具有PI熒光強(qiáng)度的菌經(jīng)過流式篩分向右偏移(圖3B下方圖);圖3C為苯乳酸作用1 h后的流式分析圖,表明細(xì)胞膜完整性破壞達(dá)到最高,已有91.9%(V3-L)的細(xì)胞有PI沾染。試驗(yàn)結(jié)果表明,苯乳酸破壞了L.monocytogenes10403s細(xì)胞膜的完整性。

表1 PLA與L. monocytogenes 10403s相互作用后的PI的沾染比率(%)Table 1 Dyeing rate of L. monocytogenes 10403s with PI after treated by PLA(%)

圖3 苯乳酸與L. monocytogenes 10403s作用后的流式分析圖Fig.3 FACS of Listeria monocytogenes 10403 after added PLA注:A為空白對(duì)照;B為苯乳酸與L. monocytogenes 10403s作用30 min;C為苯乳酸與L. monocytogenes 10403s作用1 h。

2.3.2 熒光顯微鏡法分析苯乳酸對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響 熒光顯微鏡是以紫外線為光源,在激發(fā)波長下使得被檢測(cè)物質(zhì)產(chǎn)生可測(cè)的發(fā)射波長(即熒光),即便沒有白光,也能被觀察到用以照射被檢物體,然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡能夠觀察細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、分布及定位等[22-24]。研究發(fā)現(xiàn),有些物質(zhì),如細(xì)胞中的葉綠素等,受紫外線照射后可發(fā)熒光;另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光,但如果用熒光染料或熒光抗體染色后,經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光,熒光顯微鏡是對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。

本試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于采用流式細(xì)胞從熒光強(qiáng)度的檢測(cè)表明膜完整性破壞的同時(shí),采用熒光顯微鏡鏡100倍油鏡在546 nm激發(fā)下觀察PI發(fā)出的紅色熒光,獲得PI進(jìn)入破損細(xì)胞后的效果。空白對(duì)照組在PI通道熒光顯微圖中無細(xì)胞被PI染色,即對(duì)照組A組圖像為黑色,而PLA作用1 h后的實(shí)驗(yàn)組B組如圖4所示,經(jīng)過苯乳酸作用1 h的L.monocytogenes10403s被PI沾染后觀察菌體熒光變化,圖4A為熒光顯微鏡白光圖,圖4B為PI通道熒光顯微圖,圖4C為圖4A與圖4B的導(dǎo)出合成圖,即體現(xiàn)PI標(biāo)記比率,發(fā)現(xiàn)有大于80%的細(xì)菌比例發(fā)出紅色熒光,得到MIC濃度的苯乳酸對(duì)細(xì)胞膜完整性產(chǎn)生破壞作用。

圖4 苯乳酸(MIC)與L. monocytogenes 10403s作用1 h后的熒光顯微鏡圖 Fig.4 Fluorescence microscopic images of Listeriamonocytogenes 10403s after treated by PLA(MIC)for 1 h注:A為熒光顯微鏡白光圖;B為熒光顯微鏡PI通道的電鏡圖片;C為A與B的疊加表明PI沾染的比例。

結(jié)合細(xì)胞膜的通透性分析,苯乳酸的分子結(jié)構(gòu)具有兩親性,推測(cè)與細(xì)胞膜的磷酸雙分子層具有一定的親和力,加上苯乳酸是小分子物質(zhì),使得膜對(duì)苯乳酸的阻礙減小,從而能夠吸附于膜表面,進(jìn)而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。雖然膜完整性和通透性都發(fā)生了改變,但是不能夠說明菌體的活性喪失或者分子泄露,只能說明細(xì)胞膜也是苯乳酸對(duì)單增李斯特菌發(fā)揮抑菌作用的靶位之一[21]。

2.4 苯乳酸對(duì)L. monocytogenes 10403s微觀結(jié)構(gòu)的影響

苯乳酸對(duì)菌體的抑菌效果微觀研究采用掃描電子顯微鏡,最小抑菌濃度的苯乳酸與L.monocytogenes10403s相互作用1、3、6 h后結(jié)果如圖5所示,圖5A為空白對(duì)照,菌體形態(tài)完好,表面光滑;圖5B為苯乳酸與菌體相互作用3 h的微觀結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)大部分菌體形態(tài)完好,一部分菌體表面皺縮,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變;圖5C則是作用3 h后菌體的形態(tài)變化發(fā)現(xiàn):表面有明顯的孔洞,并且菌體皺縮,疑似有內(nèi)容物外泄;D則是作用6 h的菌體互相聚集成團(tuán),有些細(xì)胞已經(jīng)失去完整形態(tài),并且由于內(nèi)容物多糖或者蛋白的粘性而發(fā)生大量聚集。從苯乳酸對(duì)L.monocytogenes10403s作用后的微觀結(jié)構(gòu)可以直觀的觀察到菌體的細(xì)胞膜的完整性和通透性都遭到了不同程度的破壞。

圖5 苯乳酸(MIC)作用于L. monocytogenes 10403s的掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.5 SEM of Listeria monocytogenes 10403s after treated by PLA(MIC)注:A為空白對(duì)照;B為苯乳酸作用1 h;C為苯乳酸作用3 h;D為苯乳酸作用6 h。

從掃描電鏡(SEM)微觀結(jié)構(gòu)中,可以直觀地觀察到微米級(jí)別的細(xì)菌菌體形態(tài),并且能夠觀察到菌體形態(tài)隨著苯乳酸作用時(shí)間延長的變化。本試驗(yàn)選擇的革蘭氏陽性(L.monocytogenes10403s)指示菌的形態(tài)變化表明,苯乳酸對(duì)食源性致病菌有很強(qiáng)的抑制作用,能夠使菌體形態(tài)在6 h內(nèi)嚴(yán)重變形,內(nèi)容物外漏,粘附在一起,達(dá)到抑菌效果,并且發(fā)揮的作用位點(diǎn)在細(xì)胞壁,細(xì)胞壁作為細(xì)菌特有的形態(tài)結(jié)構(gòu),是抑菌物質(zhì)理想的抑菌靶位,苯乳酸對(duì)細(xì)胞壁的作用同時(shí)證明了苯乳酸的抑菌優(yōu)勢(shì)。

3 討論

自從苯乳酸的廣泛抑菌性能和潛在防腐功能被發(fā)現(xiàn),對(duì)其抑菌機(jī)理的報(bào)道仍然很有限。本試驗(yàn)的掃描電鏡則得到了更多的相關(guān)信息,與Dieulevenx等[1]的研究結(jié)果相同的是,對(duì)單增李斯特菌作用6 h后菌體成團(tuán),并且有絲狀物存在,推測(cè)是多糖類物質(zhì)外泄,使得菌體互相粘連,彼此影響到生理代謝和呼吸,多種因素共同導(dǎo)致并加快了細(xì)菌死亡,不同的是在作用3 h的單增李斯特的細(xì)胞表面出現(xiàn)了很明顯的孔洞,細(xì)胞皺縮,表面不再光滑;說明苯乳酸在除了細(xì)胞壁的作用位點(diǎn)之外還有其他的作用位點(diǎn)。

2006年,Weeks等[25]研究nisin對(duì)單增李斯特菌的抑菌機(jī)理時(shí),采用FACS、PI作為與核酸結(jié)合的熒光探針,分析nisin對(duì)單增菌細(xì)胞膜的完整性的影響,發(fā)現(xiàn)nisin(8 ng/mL)對(duì)穩(wěn)定期的細(xì)胞較對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞具有更好的抑菌效果,且與nisin作用10 min后的細(xì)胞完整性破壞率達(dá)到59.9%。2012年,Li等[17]研究的抗菌肽P7,是穿膜肽PPTG.20的衍生肽,在其濃度4 μmol/L時(shí)既表現(xiàn)出對(duì)沙門氏菌的抗菌作用,同樣采用PI為熒光探針,流式細(xì)胞儀法分析細(xì)胞膜完整性發(fā)現(xiàn):P7在與沙門氏菌作用1 h后細(xì)胞膜的完整性遭到破壞達(dá)到83.47%;細(xì)菌細(xì)胞膜是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要組成部分之一,具有維持細(xì)胞完整與外界隔絕的屏障作用、物質(zhì)運(yùn)輸作用、受體作用和信息傳遞作用。苯乳酸對(duì)細(xì)胞膜的完整性由流式細(xì)胞儀測(cè)定。PI 是一種常用熒光標(biāo)記物,能顧標(biāo)記膜破損細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞膜完整性被破壞,PI才能進(jìn)入細(xì)胞與DNA復(fù)合,呈現(xiàn)強(qiáng)于未標(biāo)記細(xì)胞20～30倍的熒光信號(hào),以此判斷細(xì)胞膜的完整性[16]。本文利用PI的熒光特性研究苯乳酸對(duì)L.monocytogenes10403s細(xì)胞膜完整性的作用。

苯乳酸是兩親性的小分子,本身帶有正電荷,在與細(xì)胞膜接觸時(shí)具有吸附在表面的優(yōu)勢(shì),具有更多機(jī)會(huì)對(duì)膜發(fā)揮作用,與磷脂雙分子層的磷酸骨架結(jié)合使得磷酸骨架松散,有縫隙,隨著作用時(shí)間的增加,膜破壞的程度加深,苯乳酸能夠進(jìn)入細(xì)胞,結(jié)合本身帶有可電離的氫質(zhì)子,對(duì)菌體內(nèi)部滲透壓改變,使得菌體皺縮變形,粘連聚集得到成團(tuán)的菌體物質(zhì),最終實(shí)現(xiàn)殺滅細(xì)菌的功效。目前,研究發(fā)現(xiàn)對(duì)膜通透性改變最多的是肽類物質(zhì),并且有三種理論來支持:板桶模型、地毯模型、環(huán)形孔模型[20]。苯乳酸的抑菌機(jī)理模型更貼合桶板模型:具有兩親性的苯乳酸分子既有彼此聚合形成較大的強(qiáng)極性分子基團(tuán)的同時(shí),附著在細(xì)胞膜表面,減弱細(xì)胞膜的結(jié)合,嵌插入細(xì)胞膜中形成離子通道,從微觀結(jié)構(gòu)上觀察到的孔洞能夠證明這一推測(cè);并且熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),只有苯乳酸作用的菌體在DAPI通道中激發(fā)出微弱藍(lán)光熒光。Wang[23]在研究乳酸對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的抑菌機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)0.5%(V/V)的乳酸能夠在2 h內(nèi)使得三種菌徹底失去活性,而有乳酸的試驗(yàn)組的細(xì)胞膜則有很嚴(yán)重的損傷現(xiàn)象,細(xì)胞膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)還存在,但是細(xì)胞膜層狀結(jié)構(gòu)的完整性則遭到嚴(yán)重破壞,甚至破損,可以在細(xì)胞膜上觀察到明顯的凹點(diǎn)和裂痕[21]。苯乳酸和乳酸都是乳酸菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸,都具有一定抑菌作用,根據(jù)目前的研究成果,推測(cè)苯乳酸和乳酸一樣都對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用,但是破壞方式有所不同。對(duì)于苯乳酸對(duì)食源性致病菌的抑菌機(jī)理有待于深一步研究和完善。

4 結(jié)論

苯乳酸對(duì)革蘭氏陽性菌L.monocytogenes10403s采用熒光探針標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)苯乳酸對(duì)L.monocytogenes10403s的細(xì)胞膜通透性和完整性都有不同程度的破壞:其中FITC(FL1通道)標(biāo)記對(duì)照組的透光率為0.05%,實(shí)驗(yàn)組作用1 h后FITC的透光率達(dá)到最高值為90.06%,同時(shí),其細(xì)胞完整性在與苯乳酸作用1 h后破壞程度最大,PI(FL2通道)沾染率為 91.9%,從熒光顯微鏡圖像中更直觀地觀察到,大于80%的菌體發(fā)出紅色熒光。掃描電子顯微鏡對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)上的菌體斷裂、抱團(tuán)、粘連等現(xiàn)象的觀察,為苯乳酸的抑菌機(jī)理深入研究提供一定的理論基礎(chǔ)。