解肝磷脂土地桿菌(Pedobacter heparinus)源唾液酸醛縮酶基因的異源表達及其活性研究

, ,, ,Josef Voglmeir

(南京農業大學食品科學技術學院,糖組學與糖生物工程實驗室,江蘇南京 210095)

唾液酸是一類含九個碳原子的羧基化單糖?；苌锏目偡Q[1],通常位于糖蛋白、神經節苷脂及多糖胺等寡糖鏈末端,其主要形式包括游離的唾液酸、唾液酸衍生物及聚唾液酸[2]。唾液酸作為重要的生物信息傳遞分子在生物體內有著十分重要的生物學功能[3]。

唾液酸醛縮酶又稱N-乙酰神經氨酸裂合酶[4],是唾液酸及其類似物代謝途徑中的關鍵酶,能催化N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸生成N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)的可逆羥醛加成反應,調控唾液酸的合成[5]。唾液酸醛縮酶酶多發現于微生物體內,例如大腸桿菌(E.coli)、產氣莢膜梭菌(C.perfringens)、假單胞菌(Pseudomnoas)、變形桿菌(Proteus)及微球菌(Micrococcus)等[6]。目前已發掘了E.coli源及流感嗜血桿菌源唾液酸醛縮酶,但市面上可購買的唾液酸醛縮酶種類仍然有限,同時價格較高,因此有必要開發新的來源的唾液酸醛縮酶。解肝磷脂土地桿菌(Pedobacterheparinus)是一種從土壤中分離得到的革蘭氏陰性好氧菌[7],其全基因組信息已經公布,但關于Pedobacterheparinus源的唾液酸醛縮酶至今未見相關報道。由于唾液酸醛縮酶在該野生型菌株中為誘導酶,即通常生理狀態下不進行表達或者酶量較低,只有以價格昂貴的唾液酸作為誘導劑時才能進行大量表達[8],因此實現該酶的大量異源重組表達是大量獲得該酶的必要途徑。

目前應用最為廣泛的蛋白酶異源表達系統為大腸桿菌表達系統[9]。在該系統中,啟動子是決定基因表達水平的關鍵因素之一,對目的基因的表達載體構建及表達調控等極為重要[10]。啟動子是一段能夠識別RNA聚合酶的DNA序列,通過指導模板同全酶結合,來啟動目的基因的轉錄[11]。大腸桿菌表達系統中能發揮作用的啟動子種類較多,根據其調控方式的不同可分為誘導型啟動子和組成型啟動子[12]。其中,誘導型啟動子需添加誘導劑才能夠調控目的基因的表達,如T7·lac啟動子需以乳糖類似物作為誘導劑,該類型啟動子的優點是能夠掌握酶的表達時間和水平[13]。最近的研究報道中,已有不少學者選用組成型啟動子來調控外源基因的表達,該類型的啟動子能夠在細胞開始生長時就自主表達異源蛋白酶,無需添加誘導劑,具有調控方式更為簡便、操作成本低等優點[14]。

針對大腸桿菌表達系統中兩種啟動子各有優勢的特點,本研究先以大腸桿菌表達載體pRSFDuet-1為骨架,設計插入組成型啟動子,合成組成型表達載體。再以細菌屬Pedobacterheparinus作為目標菌株,將其擬編碼唾液酸醛縮酶的基因PhNeuLy3300進行擴增,并構建至上述含組成型啟動子的表達載體及含誘導型啟動子的商業表達載體pET-30a,分別以誘導型啟動子和組成型啟動子對Pedobacterheparinus源唾液酸醛縮酶進行體外異源表達,旨在以較為經濟、簡易的表達條件得到重組唾液酸醛縮酶。其中,將含誘導型啟動子的pET-30a商業載體表達所得的唾液酸醛縮酶進一步純化及活性測定,以期得到能運用于后續體外酶學特性研究的純酶,通過對組成型表達載體表達所得的粗酶進行酶活驗證,為唾液酸醛縮酶在大腸桿菌體內合成唾液酸的應用奠定基礎,同時也為重組蛋白的表達提供一種新型、高效、方便的表達載體。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Pedobacterheparinus(DSM 2366) 德國(DSMZ)微生物與細胞保藏中心;基因克隆菌株Top10(經抗噬菌體改后造命名為BMMach1 T1)和大腸桿菌表達菌株E.coliBL21(DE3) 北京天根生化科技有限公司;pGH-T克隆載體 上海捷瑞公司;pET-30a和pRSFDuet-1表達載體 Novagen公司;組成型調控基因序列EM5和PCR擴增引物 由本實驗室設計后交南京金斯瑞(genescript)公司合成;rTaq DNA聚合酶 Takara公司;T4 DNA連接酶、去磷酸化酶FastAP以及限制性核酸內切酶Nde I、Xho I Thermo Scientific公司;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 北京索萊寶科技有限公司;卡那霉素(50 μg/mL)和氨芐青霉素(100 μg/mL) 南京壽德生物科技有限公司;AxyPrep DNA回收試劑盒和AxyPrep 質粒提取試劑盒 Axygen公司;基因測序 南京金斯瑞(genescript)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原核表達載體pRSF-EM5的設計合成 首先利用SnapGene軟件分析具有不同抗性基因標簽的表達載體圖譜,獲取各類抗性基因(殺稻瘟菌素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素及潮霉素等)的調控序列,根據Neutral networkpromoter prediction及Vector NTI(V10.0)等軟件工具的分析,認為可以其為組成型啟動子設計組成型基因調控序列(EM5)模塊。該模塊由5組酶切位點(Nde I/Xho I、EcoR I/Pme I、Kpn I/Spe I、Sac I/Mfe I及Bgl II/Avr II)與各啟動子相互串聯形成相對獨立的表達盒,并在序列最前面引入Nco I酶切位點。設計的EM5序列交由南京金斯瑞公司合成,再經Nco I、Avr II雙酶切后,連接至商業載體pRSFDuet-1,即定向改造得到新的組成型原核表達載體pRSF-EM5。

1.2.2 綠色熒光蛋白在pRSF-EM5載體中的表達 為檢測改造后的載體pRSF-EM5能否由組成型啟動子啟動并完成異源蛋白的自主表達,將編碼綠色熒光蛋白的基因(GFP)兩端分別添加限制性內切酶位點Nde I/Xho I、EcoR I/Pme I、Kpn I/Spe I、Sac I/Mfe I、Bgl II/Avr II,經聚合酶鏈式反應(PCR)擴增后,分別連接至pRSF-EM5載體,再將連接產物熱激轉化至大腸桿菌感受態細胞(BMMach1 T1細胞)中,利用PCR法篩選重組轉化子,最后利用Axygen質粒提取試劑盒提取陽性菌落質粒并導入E.coliBL21(DE3)細胞。其中PCR反應體系如表1所示,PCR各引物序列如表2所示,PCR程序設置為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,循環 35 次,72 ℃ 10 min。挑取適量含重組GFP基因的E.coliBL21(DE3)菌株于5 mL LB培養基中,30 ℃、200 r/min培養表達20 h。待表達完成后,12000 r/min離心收集菌體,于藍光板上觀察菌體顏色。

表2 綠色熒光蛋白基因PCR引物序列Table 2 Primers for PCR amplification of GFP genes

表1 綠色熒光蛋白基因PCR反應體系Table 1 PCR amplification reaction system of GFP genes

1.2.3Pedobacterheparinus唾液酸醛縮酶基因擴增 通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)數據庫比對,從Pedobacterheparinus基因組中篩選到疑似編碼唾液酸醛縮酶的基因序列,命名為PhNeuLy3300。利用軟件Primer Premier5設計其PCR擴增引物,并在引物的5′端分別引入Nde I、Xho I限制性內切酶位點。前引物F:5′-CATATGATGACGATGCAAAAATT AGAA-3′,后引物R:5′-CTCGAGTTATTGTGAAGTG CTGACGC-3′。PCR反應體系如表3所示,其具體擴增程序為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,循環35次,72 ℃ 10 min。Pedobacterheparinus基因組DNA根據Mahuku[15]等報道的方法進行提取。以基因組DNA為模板進行目的基因的PCR擴增,擴增所得產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析,并利用Axygen DNA 回收試劑盒進行切膠回收。

表3 唾液酸醛縮酶基因PCR反應體系Table 3 PCR amplification reaction system of PhNeuly3300

1.2.4 重組表達載體的構建 回收的DNA片段經T4 DNA連接酶作用,連接至pGH-T克隆載體上,再將重組質粒轉化至BMMach1 T1細胞中,使用藍白斑法篩選重組轉化子[16],并挑取白色單菌落以M13通用引物進行PCR法鑒定。利用Axygen質粒提取試劑盒對陽性菌落進行質粒抽提,得到的質粒經Nde I、Xho I限制性內切酶進行雙酶切,酶切后的DNA片段在T4 DNA連接酶的作用下,分別連至經相同酶切處理的pET-30a和pRSF-EM5表達載體上。再將連接產物轉化至BMMach1 T1細胞中,并利用PCR法篩選重組轉化子,得到的陽性菌落分別送至公司進行測序,得到構建成功的重組質粒pET-30a-PhNeuLy3300和pRSF-EM5-PhNeuLy3300。

1.2.5 唾液酸醛縮酶的異源表達和純化 提取重組質粒pET-30a-PhNeuLy3300和pRSF-EM5-PhNeuLy3300,轉化至E.coliBL21(DE3)細胞內。分別挑取單菌落于5 mL含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養基中過夜培養,然后接種至400 mL LB培養基中進行擴大培養。其中含重組質粒pRSF-EM5-PhNeuLy3300的菌液于30 ℃、200 r/min條件下培養表達20 h,含重組質粒pET-30a-PhNeuLy3300的菌液于37 ℃、200 r/min條件下培養直至菌液濃度達到OD600為0.5～0.7,加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1 mmol/L,轉18 ℃繼續誘導表達20 h。

4 ℃、4000 r/min離心收集菌體,利用10 mL細胞裂解液(100 mmol/L氯化鈉,1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),50 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF))將菌體沉淀重懸。將含重組質粒pET-30a-PhNeuLy3300的裂解液經超聲進行細胞破碎,4 ℃、12000 r/min離心收集上清,再利用鎳親和層析柱(Ni-NTA)進行純化。純化柱經5倍柱體積的平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L氯化鈉,pH8.0)平衡后上樣,再由10倍柱體積的結合緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,20 mmol/L咪唑,50 mmol/L氯化鈉,pH8.0)沖洗去除非特異性結合的蛋白,最后用10 mL體積的洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L氯化鈉,500 mmol/L咪唑,pH8.0)洗脫目標蛋白,280 nm波長檢測洗脫液,收集重組蛋白酶。

將重組蛋白pRSF-EM5-PhNeuLy3300細胞裂解液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),以不含目的重組質粒的E.coliBL21(DE3)細胞裂解液為對照,分析重組蛋白的表達水平。另取pET-30a-PhNeuLy3300誘導前后、上清和純化后樣品進行SDS-PAGE,以分析不同載體中重組酶的表達水平及純化情況。其中,分離膠電泳電壓均為100 V,濃縮膠電泳電壓均為80 V。并使用Bradford法的蛋白定量試劑盒,以牛血清蛋白(BSA)繪制標準曲線,測定純化后的pET-30a-PhNeuLy3300重組蛋白酶濃度,具體操作按說明書進行。

1996年，Worden和Smalley[16]通過研究碳酸鹽油氣藏中生成H 2 S的化學反應，并結合標志元素硫、碳的同位素數據，烴類與CaSO4的反應方程見式(7)～式(9):

1.2.6 唾液酸醛縮酶的活性測定 重組唾液酸醛縮酶的活性通過酶標儀進行測定。以N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac,400 μmol/L)為底物,與輔酶 I(NAD+,2 mmol/L)、磷酸鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol/L,pH6.5)、N-乙酰甘露糖胺脫氫酶(ManNAc Dehydrogenase,10 mU)混合后加入384孔酶標板,最后分別加入純化后的pET-30a-PhNeuLy3300重組蛋白酶(純酶,25 μL)和pRSF-EM5-PhNeuLy3300 細胞裂解液(粗酶,25 μL),立即放入酶標儀內,在340 nm波長處進行實時檢測(每20 s讀數1次(s),共讀數700次,溫度37 ℃)。以不含Neu5Ac或不含目的重組蛋白酶的組分為陰性對照,其中不含底物的體系以等體積去離子水替代Neu5Ac,其余組分均保持不變,不含目的重組蛋白酶的體系以等體積大腸桿菌細胞裂解上清液(原菌株不含表達目的重組蛋白酶的質粒)替代,其余組分均保持不變。

1.3 數據處理

實驗中蛋白酶濃度的測定及重組酶活測定每組重復三次,采用Microsoft Excel 2016軟件進行數據整理與曲線圖的繪制,應用Adobe Illustrator CS5軟件輔助作圖。

2 結果與分析

2.1 原核表達載體的改造

商業載體pRSFDuet-1為大腸桿菌蛋白雙基因表達載體,含兩個多克隆位點,即該載體由兩個T7·lac啟動子起始轉錄,因此在大腸桿菌表達系統中需添加IPTG作為誘導劑才能表達異源目標蛋白[17]。為使pRSFDuet-1載體免受誘導劑影響,自主表達外源蛋白,本實驗設計了組成型調控序列EM5模塊。如圖1所示,該模塊由表達抗性基因殺稻瘟菌素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素及潮霉素的調控序列和5組克隆位點相互串聯組成,并于各組克隆位點前引入ATG堿基,序列總長為544 bp。其中抗性基因的調控序列能夠作為組成型啟動子自主啟動插入的目的基因的表達,5組酶切位點Nde I/Xho I、EcoR I/Pme I、Kpn I/Spe I、Sac I/Mfe I及Bgl II/Avr II可作為多克隆位點同時插入5種目標蛋白基因,為多基因共表達的實現提供基礎。

圖1 組成型調控序列EM5的設計Fig.1 Design of constitutive regulatory gene sequence EM5

EM5模塊與pRSFDuet-1載體的整合位點如圖2所示,組成型調控序列(EM5,B)替換了原載體上的多克隆位點序列(MCS1-MCS2,A),并保留了原載體上第一個T7·lac啟動子和核糖體結合位點(Ribosome Binding site,RBS)。根據設計,改造后的pRSF-EM5載體理論上可在大腸桿菌表達系統中同時自主表達5種目的蛋白,不需添加誘導劑。

圖2 商業載體pRSFDuet-1與組成型調控序列的整合Fig.2 Integration of pRSFDuet-1 vector and constitutive regulatory gene sequence注:A:商業載體pRSF-Duet1圖譜;MCS:多克隆位點;B:組成型表達載體圖譜。

2.2 綠色熒光蛋白的表達

鑒于編碼綠色熒光蛋白基因序列較短,構建載體方便[18],因此可將綠色熒光蛋白基因克隆至pRSF-EM5載體中,檢測改造后的組成型載體是否能夠自主表達綠色熒光蛋白,以驗證改造后的新載體的功能。

由于EM5的序列設計有5組可用于插入目的基因,因此本研究將綠色熒光蛋白基因分別構建至pRSF-EM5載體上Nde I/Xho I、EcoR I/Pme I、Kpn I/Spe I、Sac I/Mfe I、Bgl II/Avr II等5個克隆位點進行重組表達。重組綠色熒光蛋白的表達結果如圖3所示:5組含重組綠色熒光蛋白質粒的菌體沉淀均能在藍光下發出較強的綠色熒光,而不含該重組綠色熒光蛋白質粒的菌體則無明顯可見光,證明設計合成的組成型啟動子能被大腸桿菌宿主識別,改造后的載體pRSF-EM5能夠在無誘導劑存在的條件下,自主表達插入的外源目的蛋白,從而證明組成型啟動子的表達載體構建成功,且每一個克隆位點都具有正常功能,可以單獨用于外源基因的插入和表達。除此以外,該載體可以同時承載多個能夠自主啟動表達的克隆位點,因此可用于進行多個基因共表達的嘗試。

圖3 重組載體上綠色熒光蛋白自主表達Fig.3 Constitutive expression of GFP with constructed recombinant vector

2.3 目的基因克隆及序列比對

利用生物信息學同源比對的方法,從Pedobacterheparinus(DSM2366)基因組中找到疑似編碼唾液酸醛縮酶的基因,并命名為PhNeuLy3300,基因為全長945 bp。通過PCR擴增獲得了該完整基因,雙酶切后分別與含誘導型啟動子的pET-30a及含組成型啟動子的pRSF-EM5表達載體連接構建成重組質粒,對質粒進行目標基因序列的PCR擴增后,瓊脂糖凝膠電泳驗證了插入基因片段的大小,如圖4所示,pET30a-PhNeuLy3300及pRSF-EM5-PhNeuLy3300的DNA片段均為單一條帶且與預期的理論基因大小一致,證明插入片段正確。

圖4 PhNeuLy3300基因PCR結果Fig.4 PCR result of PhNeuLy3300 genes注:M:DNA分子量標準(bp),1:pET30a-PhNeuLy3300基因,2:pRSF-EM5-PhNeuLy3300基因。

測序結果表明克隆得到的重組pET30a-PhNeuLy3300基因及重組pRSF-EM5-PhNeuLy3300基因均與Pedobacterheparinus基因序列匹配。如圖5、圖6所示,完整開放閱讀框全長945 bp,共編碼314個氨基酸殘基,且pET30a-PhNeuLy3300帶有C-端組氨酸標簽,而pRSF-EM5載體不帶組氨酸標簽,也即pRSF-EM5-PhNeuLy3300無C-端組氨酸標簽。兩組測定序列與GeneBank公布的相應序列同源性均為100%,證明插入片段即為目的基因片段,重組質粒構建成功。

圖5 pET30a-PhNeuLy3300酶基因的測序比對結果Fig.5 Comparison result of pET30a-PhNeuLy3300 genes

圖6 pRSF-EM5-PhNeuLy3300酶基因的測序比對結果Fig.6 Comparison result of pRSF-EM5-PhNeuLy3300 genes

2.4 重組蛋白的表達和純化

含重組質粒pET30a-PhNeuLy3300的大腸桿菌經IPTG誘導前后菌體、裂解所得上清液和鎳親和層析柱純化組分的SDS-PAGE分析結果如圖8(A)所示。通過比較IPTG誘導前后菌體的蛋白樣品,可見誘導后菌體在分子量30～40 kDa左右具有一明顯增強條帶,且裂解上清液和純化后的樣品在相同位置都具有信號,應為所表達重組蛋白PhNeuLy3300,其表觀分子量與理論分子量36.4 kDa相符合,表明重組質粒pET30a-PhNeuLy3300可在大腸桿菌表達系統中經IPTG誘導進行表達,經鎳柱純化可得到純度較高的重組蛋白。由改良型Bradford試劑盒測定,所得蛋白濃度-吸光度標準曲線如圖7所示,根據相同條件下待測蛋白樣品的吸光值以及樣品稀釋倍數,計算出pET30a-PhNeuLy3300重組蛋白濃度為3.29 mg/mL。

圖7 蛋白質濃度標準曲線Fig.7 Standard curve of protein concentration注:BSA:牛血清蛋白

圖8 PhNeuly3300酶SDS-PAGE電泳圖Fig.8 SDS-PAGE electrophoresis of recombined PhNeuLy3300注:(A)pET30a-PhNeuLy3300重組蛋白酶SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白分子量標準(kDa);1:IPTG誘導前菌體;2:IPTG誘導后菌體;3:細胞裂解液上清;4:鎳親和層析柱純化后蛋白。(B)pRSF-EM5-PhNeuLy3300重組蛋白酶SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白分子量標準(kDa);1:細胞裂解液上清(原菌株不含pRSF-EM5-PhNeuLy3300質粒);2:細胞裂解液上清(原菌株含pRSF-EM5-PhNeuLy3300質粒)。

含重組質粒pRSF-EM5-PhNeuLy3300的大腸桿菌在無誘導劑添加的條件下進行培養,裂解菌體所得上清液的SDS-PAGE分析結果如圖8(B)所示。通過與不含目的重組質粒的大腸桿菌上清液進行比較,可見含重組質粒pRSF-EM5-PhNeuLy3300的菌體在分子量30～40 kDa左右具有一增加的蛋白條帶,且表觀分子量與目的蛋白理論分子量36.4 kDa相吻合,即為所表達的重組蛋白PhNeuLy3300,表明重組質粒pRSF-EM5-PhNeuLy3300可在大腸桿菌表達系統中經組成型啟動子作用進行自主表達。

2.5 重組唾液酸醛縮酶的活性研究

唾液酸醛縮酶可以催化可逆的唾液酸裂解生成N-乙酰-甘露糖胺與丙酮酸的反應,故可利用從Neu5Ac轉化為N-乙酰-甘露糖胺的酶促反應檢測PhNeuLy3300酶的活性。N-乙酰-甘露糖胺的檢測則由N-乙酰-甘露糖胺脫氫酶完成。N-乙酰-甘露糖胺脫氫酶能將N-乙酰-甘露糖胺氧化,同時將NAD+還原成NADH,NADH在紫外340 nm下可檢測吸光值。故可通過酶標儀驗證是否有NADH生成從而間接檢測重組PhNeuLy3300酶是否有活性。

活性檢測結果如圖9所示,pRSF-EM5-PhNeuLy3300粗酶(細胞裂解液)催化底物Neu5Ac的反應(組1),1 h內340 nm處吸光值快速增加且達到最大值;當pET30a-PhNeuLy3300純酶與底物Neu5Ac同時存在時(組2),340 nm處吸光值明顯升高,但反應速率相對緩慢,3 h后340 nm處的吸光值達到最大;而反應中不含底物NeuAc(組3),或不含重組PhNeuLy3300酶時(組4),340 nm處吸光值沒有增加;表明N-乙酰-甘露糖胺脫氫酶不能以Neu5Ac為底物進行反應,可判斷經誘導型和組成型啟動子表達所得的唾液酸醛縮酶PhNeuLy3300均具有較好的活性。

圖9 重組PhNeuly3300酶活性檢測圖Fig.9 Enzyme activity detection of PhNeuLy3300注:組1:pRSF-EM5-PhNeuLy3300重組蛋白酶的活性檢測;組2:pET30a-PhNeuLy3300重組蛋白酶的活性檢測;組3:不含底物Neu5Ac的活性檢測反應;組4:不含PhNeuLy3300目的重組酶的活性檢測反應。

3 討論

發掘新型唾液酸醛縮酶、構建其工程菌,可有效提高唾液酸醛縮酶的異源表達量,免去其在野生型菌株中表達所必需的誘導劑N-乙酰神經氨酸,解決在應用研究中市售商品酶來源稀缺等問題。在過去的二十年里,成千上萬的微生物基因組序列已被測出。對這些基因數據進行系統分析,利用基因工程技術克隆并構建重組蛋白酶表達體系,是得到新型唾液酸醛縮酶最簡單高效的途徑[19]。

本論文利用NCBI等相關網站和軟件,對一些酶的基因數據進行分析,在基因序列比對的基礎上,從來自土壤中的Pedobacterheparinus細菌中獲得了唾液酸醛縮酶基因片段。據相關資料顯示,Pedobacterheparinus俗稱肝素黃桿菌[20],一般生長于土壤中,該菌種最適生長環境溫度為25～30 ℃[21],其作為唾液酸醛縮酶基因的供體菌極易獲得。此外,文獻報道Dietrich及其同事曾從Pedobacterheparinus細菌中發現其他與糖代謝密切相關的酶,如軟骨素酶、肝素合成酶、硫酸酯酶、硫代酰胺酶等[22],且這些酶在實際的糖合成應用中都具有較高的價值,證實Pedobacterheparinus菌株可以作為研究糖代謝途徑相關酶的重要基因庫[23]。本文是首次從Pedobacterheparinus基因組中克隆表達得到了一種新的具有較高活性的唾液酸醛縮酶,豐富了該酶的資源。后續將進一步開展對該酶的生物酶學特性以及實際應用效果的研究,為該酶的開發利用打下基礎。

在構建重組蛋白酶的工程菌過程中,選擇合適的表達載體作為骨架尤其關鍵。表達載體的核心則是啟動子,其直接影響目的基因表達方式的經濟性以及重組蛋白的表達水平。在大腸桿菌系統中,應用較多的是帶有lac/trc/tac以及T7啟動子的系列表達載體[24],其中pET系列載體是該類載體的典型代表。本研究中也選擇了以含有T7·lac啟動子的pET-30a為載體,構建重組唾液酸醛縮酶表達體系,實驗結果證明該重組體系僅需以廉價的IPTG為乳糖類似物誘導劑即可表達獲得濃度較高的重組唾液酸醛縮酶,載體C端帶有的組氨酸標簽也解決了目前野生型菌株中低量唾液酸醛縮酶難以分離純化等問題。但隨著基因工程技術的發展,通常需要表達載體能夠進一步滿足更經濟、更簡便的調控方式的需要,因此組成型啟動子的研究應用越來越廣泛。國內杜麗琴等人曾報道過從宏基因文庫中克隆出組成型啟動子構建至T-載體中[25],成功利用構建的含組成型的啟動子表達出了具有活性的淀粉酶,但其組成型啟動子的篩選步驟繁瑣,得到陽性克隆子的成功率低,且該改造后的載體只含有單個多克隆酶切位點。本研究則以啟動抗性基因表達的調控序列為組成型啟動子,對商業載體pRSF-Duet1進行改造,方法簡易可行。構建的重組質粒pRSF-EM7-PhNeuLy3300在無任何誘導劑添加的情況下成功表達出了具有活性較強的唾液酸醛縮酶,大大降低了唾液酸醛縮酶的表達成本。

本文只利用該改造的pRSF-EM5載體進行了唾液酸醛縮酶的表達。實際上本研究改造后的載體理論上能同時獨立自主表達5種蛋白酶,并在本實驗室開展的大腸桿菌體內合成糖胺聚糖的研究中成功實踐了兩種基因的共表達。該研究將編碼UDP-葡萄糖異構酶及β-1,4半乳糖基轉移酶的基因同時串接至pRSF-EM5載體上,使其在大腸桿菌表達系統中自主表達,并以大腸桿菌體內糖代謝中的UDP-葡萄糖為底物,同時外源補給pNP-木糖受體,在共表達的兩種重組酶作用下,于大腸桿菌體內檢測到了合成的pNP-木糖-半乳糖,即pRSF-EM5載體可于同一宿主菌株中同時表達兩種目的蛋白酶且兼具活性?？偠灾?該組合型表達載體的成功構建進一步提供了組成型啟動子在多基因共表達的實現過程中的可能性,為生物體內多酶法的合成途徑奠定了基礎。

4 結論

本文通過對商業載體pRSF-Duet1進行定向改造,合成了可自主表達多種外源蛋白的RSF-EM5載體,利用PCR法成功獲得了Pedobacterheparinus菌株中參與合成唾液酸的唾液酸醛縮酶基因,該基因長度約為945 bp。同時采用基因工程技術將該唾液酸醛縮酶基因分別連至大腸桿菌pET 30a載體及RSF-EM5載體,成功構建了兩種重組唾液酸醛縮酶質粒。經大腸桿菌表達系統進行異源表達后,發現兩種重組質粒均能有效表達目的蛋白酶,其分子量大小與預期相符,且具有較高的催化活性。目前課題組正在研究該酶的酶學特性及其在生物內體合成唾液酸的應用,以期進一步探索該酶的實用價值。