兩種火龍果果皮紅色素提取工藝優化及其抗氧化活性

, , ,楊玉,,

(1.肇慶學院生命科學學院,廣東肇慶 526061;2.肇慶學院食品與制藥工程學院,廣東肇慶 526061)

目前,食品、飲料、酒類、糕點、藥業、化妝品等行業廣泛應用著色劑,這種著色劑俗稱色素。色素是一種重要的食品添加劑,在食品生產過程中,生產者為了改善食品的色、香、味等感官品質,往往使用人工合成色素來增強食品的著色效果。在食品著色劑中,紅色素是一類非常重要的食品色素。紅色色調能刺激人的大腦,給人以興奮感,有增加食欲和增強購買欲的作用,因此紅色素被廣泛應用于食品中。目前,我國常用的食品級人工合成紅色素主要有莧菜紅、胭脂紅等,但大都有其限量標準。研究表明,某些人工合成紅色素超量使用會對人體健康造成慢性中毒、致病致癌等危害,相比而言,天然紅色素大部分來源于植物色素,絕大多數無副作用,安全性高,因此消費者更青睞于添加天然紅色素的食品[1]。從植物中提取安全無毒并具有特殊生物活性的天然食用紅色素,已成為現時著色劑研究的熱點。

甜菜紅素(Betalains)是一種吲哚來源的天然植物紅色素,主要存在于石竹目仙人掌科、藜科及莧科等植物紅色組織中,在植物抗逆生理保護機制中發揮重要的作用。甜菜紅素是一種安全無毒害、兼有一定營養保健功效的天然色素,具有抗氧化、預防腫瘤、降低血脂、減緩肌肉疲勞等作用[2]。在1976年,聯合國FAO/WHO食品添加劑聯合專家委員會便制定了甜菜紅素的使用標準。目前,市場上出售的甜菜紅素大都以食用紅甜菜為原料加工而成。甜菜紅素的提取方法很多,由于甜菜紅素溶于水,水浸提法是最常用的提取方法,此外如超聲波輔助萃取技術[3]、超臨界萃取技術[4]以及膜處理技術[5]等輔助方法也見諸于文獻報道。

火龍果(HylocereusundutusL.)又稱紅龍果、仙蜜果,是仙人掌科三角屬多年生多漿植物果實,最先在巴西、墨西哥等熱帶地區種植,目前在我國的海南、廣東、廣西、福建等省份均有種植[6]。近年,隨著廣東省肇慶市農業產業轉型升級,肇慶市鼎湖區蓮花、高要區白諸、蓮塘、白土等鎮均大規模種植白肉紅皮、白肉黃皮和紅肉紅皮等品系火龍果。白肉紅皮火龍果果皮和紅肉紅皮火龍果果肉及果皮都含有大量的紅色素,為甜菜苷類水溶性天然色素[7-9]。火龍果果皮雖然富含紅色素,但在食用或加工過程中常常作為廢棄物,不僅加重了環境治理的負擔,還造成了可利用植物色素資源的浪費。因此,對火龍果果皮紅色素提取工藝及其生物活性的研究,可明顯提升火龍果加工的附加值。目前,有學者分別對火龍果果肉或果皮中紅色素的提取工藝做了初步探究,但對該天然紅色素的科學分類屬于“花色苷”或“ 甜菜色素”還存在疑義[10-12]。

本文在鑒定火龍果果皮紅色素種類的基礎上,采用超聲波輔助乙醇浸提法,運用單因素實驗和正交試驗優化色素提取工藝,綜合比較兩個品種火龍果果皮紅色素的抗氧化活性,旨在為肇慶地區火龍果品種選育及果皮的合理深化利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紅肉紅皮和白肉紅皮火龍果 廣東省肇慶市農業局提供,洗凈,晾干,去掉果肉及綠色果皮部分,剪成條狀物,50 ℃烘干,粉碎,過40目篩,果皮粉末分別標記為紅肉紅皮(RP)和白肉紅皮(WP),密封備用;甜菜紅素標準品 上?？道噬锟萍加邢薰?1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·) 上海品純試劑有限公司;甲醇 成都市科龍化工試劑廠;無水乙醇 天津市北聯精細化學品開發有限公司;鐵氰化鉀、亞硝酸鈉 天津市廣成化學試劑有限公司;水楊酸 天津市福晨化學試劑廠;對氨基苯磺酸、硫酸亞鐵、雙氧水 廣州化學試劑廠;三氯乙酸 天津市大茂化學試劑廠;鹽酸萘乙二胺、三氯化鐵 天津市科密歐化學試劑有限公司;以上試劑 均為分析純。

KJ-B型600 W超聲波清洗機 廣州番禺科進超聲波設備廠;40B型臺式離心機 上海安亭儀器有限公司;UV759紫外-可見分光光度計、JA2003型電子天平 上海精科儀器有限公司;UPLC-XEVO TQD超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜聯用儀 愛爾蘭Waters公司;AB-8大孔樹脂吸附柱、SD-B凍干機、RE-52型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司;DHG-9240A型電熱鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;Q-300B旗箭中藥五谷干磨粉碎機 上海冰都電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 火龍果果皮紅色素粗提物的制備 準確稱取兩個品種的火龍果果皮粉末各10 g,分別加入50%乙醇(v/v,下同)溶液50 mL,置于50 ℃超聲波頻率28 kHz的超聲波清洗儀中浸提30 min,減壓抽濾,真空濃縮30 min,50 ℃電熱鼓風干燥24 h,密封放置4 ℃冰箱備用。

1.2.2 火龍果果皮紅色素粗提物的分析鑒定 紫外可見光譜法:分別取等量的色素抽濾液,用去離子水稀釋10倍后,在450～700 nm范圍內進行光譜掃描。

高效液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS/MS)[13]:分別稱取火龍果果皮色素粗提物各10 mg,加入1 mL去離子水,渦旋30 s,用微孔濾膜(0.22 μm)濾過,取濾液進樣,進樣量為10 μL。HPLC-MS/MS檢測條件:流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液(60/40,v/v),流速為0.3 mL/min;色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEN C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);質譜條件:離子源:ESI源,正離子掃描,多反應監測;毛細管電壓:2.50 kV;離子源溫度:150 ℃。在確定母離子的基礎上,采用子離子掃描方式對其進行二級質譜分析,對子離子進行優化選擇,確定定量離子和定性離子(表1)。

表1 ESI+模式下甜菜紅素參數設定Table 1 MS/MS acquisition parameters for betalain at ESI+ mode

1.2.3 甜菜紅素得率的測定

1.2.3.1 甜菜紅素含量的測定 參考袁亞芳等[14]的方法,采用摩爾消光系數法計算提取液中甜菜紅素的含量。

C(g)=(OD538×550.11)/61600

式(1)

式(1)中,C為甜菜紅素含量,OD538為吸光值,550.11為標準甜菜紅素摩爾分子質量,61600為標準甜菜紅素摩爾消光系數。

1.2.3.2 甜菜紅素得率計算

得率(%)=[(C×V)÷m]×100

式(2)

式(2)中,C為提取液中甜菜紅素含量(g),V為提取液體積(mL),m為果皮粉末質量(g)。

1.2.4 火龍果果皮甜菜紅素提取的單因素實驗 定量稱取兩個品種火龍果果皮粉末若干份,經過預實驗,分別在不同乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度等條件下進行單因素實驗,以甜菜色素得率為指標,得出單因素實驗的最佳條件。

1.2.4.1 乙醇濃度對甜菜紅素得率的影響 稱取0.50 g火龍果果皮粉末,按料液比1∶50 (g/mL)的比例,分別加入濃度為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液,于40 ℃超聲波清洗儀中恒溫提取25 min,減壓抽濾,取上濾液在538 nm波長下測定甜菜紅素含量。

1.2.4.2 料液比對甜菜紅素得率的影響 分別稱取0.50 g果皮粉末,RP按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)的比例,WP按照料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 (g/mL)的比例加入40%乙醇溶液,于40 ℃超聲波清洗儀中提取25 min。用40%乙醇溶液定容到50 mL,減壓抽濾,取上濾液在538 nm波長下測定甜菜紅素含量。

1.2.4.3 超聲時間對甜菜紅素得率的影響 稱取0.50 g兩個品種火龍果果皮粉末,RP按料液比1∶20 (g/mL)、WP按料液比1∶50 (g/mL)的比例加入40%乙醇溶液,于40 ℃超聲波清洗儀中,RP分別提取5、10、15、20、25 min,WP分別提取15、25、35、45、55 min,減壓抽濾,取上濾液在538 nm波長下測定甜菜紅素含量。

1.2.4.4 超聲溫度對甜菜紅素得率的影響 稱取0.50 g的兩種火龍果果皮干燥粉,RP按料液比1∶20 (g/mL),WP按料液比1∶50 (g/mL)的比例加入40%乙醇溶液,于30、40、50、60、70 ℃溫度下超聲波清洗儀中,RP提取10 min,WP提取35 min,減壓抽濾,取上濾液在538 nm波長下測定甜菜紅素含量。

1.2.5 火龍果果皮甜菜紅素提取工藝正交試驗 根據單因素實驗結果,選擇乙醇濃度、料液比、超聲時間和超聲溫度4個因素進行正交試驗,進一步研究提取火龍果果皮色素的最佳提取工藝,兩種品種火龍果果皮色素提取各因素水平如表2所示,選用L9(34)正交試驗表進行試驗設計。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.6 甜菜紅素粗提物的純化 確定最佳提取條件后,按照如下流程提取純化果皮甜菜紅素。稱取兩種火龍果果皮粉末10 g,分別以最佳提取條件提取甜菜紅素抽濾液。抽濾液上樣AB-8大孔樹脂吸附柱充分吸附,去離子水洗滌去雜質,用30%乙醇解吸附,洗脫液即為火龍果果皮甜菜紅素提純液。提純液減壓濃縮(壓力為0.08 MPa,溫度為40 ℃)處理后,凍干機進行冷凍干燥(真空度0.09 MPa,溫度為-40 ℃),得到火龍果果皮甜菜紅素的提純物,稱重計算產量,避光保存備用[15]。

1.2.7 兩種火龍果果皮甜菜紅素抗氧化活性的測定 將上述火龍果果皮提純物用去離子水配制為各濃度溶液,綜合檢測果皮甜菜紅素的抗氧化活性。

式(3)

1.2.7.2 對羥自由基(·OH)清除率的測定 取不同質量濃度(1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL)的兩種品種果皮色素液各1 mL于具塞試管中,分別加入6 mmol/L硫酸亞鐵溶液、6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、6 mmol/L 過氧化氫各2 mL,37 ℃恒溫水浴35 min,于波長為510 nm處測定吸光值,記為Ax,以2 mL雙蒸水作為空白組,測得吸光值記為A0,沒有加入過氧化氫溶液測定的吸光值記為Ax0[18]。通過式(4)計算·OH清除率。

式(4)

式(5)

1.2.7.4 總還原力的測定 取不同質量濃度(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)的果皮色素液各2.5 mL,加入pH6.6磷酸緩沖液(0.2 mol/L)2.5 mL和10 g/L鐵氰化鉀1.5 mL,50 ℃水浴20 min,加入100 g/L三氯乙酸1.5 mL,于3000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,加2.5 mL蒸餾水和1 g/L三氯化鐵0.5 mL,10 min后于波長700 nm處測定其吸光度[20]。

1.3 數據處理

以上實驗均平行測定3次,實驗結果以均值±標準偏差表示。采用數據處理軟件SPSS 19.0及Design Expert 8.05對所得實驗數據進行分析,采用Origin Pro 9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 火龍果果皮紅色素物質的鑒定

由圖1可見,兩種火龍果果皮紅色素的吸收光譜最大吸收峰都在538 nm處,與甜菜紅素標準物的吸收峰值一致。同時,經HPLC-MS/MS檢測結果表明(圖2),紅肉紅皮和白肉紅皮火龍果的果皮紅色素為甜菜紅素?？梢?經紫外光譜和液質聯用法鑒定,兩種火龍果果皮色素均為甜菜紅素,并且在相同的實驗條件下,粗提物RP中甜菜紅素的OD值均高于WP,表明RP中甜菜紅素相對含量高于WP。

圖1 火龍果果皮紅色素的吸收光譜及相對含量Fig.1 Absorption spectra and relative content of betalains in the pitaya peel

圖2 火龍果果皮甜菜紅素的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of betalains from the pitaya peel

2.2 兩個品種火龍果果皮甜菜紅素提取工藝的優化

2.2.1 單因素實驗

2.2.1.1 乙醇濃度對火龍果果皮甜菜紅素得率的影響 由圖3可知,當乙醇濃度為30%～40%,兩種果皮甜菜紅素的得率均隨乙醇濃度的增加而逐漸提高,乙醇濃度達40%時,甜菜紅素得率均達到最大值,而后隨著乙醇濃度的增加,甜菜紅素的得率反而下降。這可能是由于火龍果皮甜菜紅素是水溶性色素,高濃度的有機溶劑反而對甜菜紅的溶解起抑制作用。據此選擇30%、40%、50%的乙醇濃度,作為正交試驗的3個水平。

圖3 乙醇濃度對火龍果果皮甜菜紅素提取的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction of betalains from pitaya peel注:a:WP;b:RP。圖4～圖6同。

2.2.1.2 料液比對火龍果果皮甜菜紅素得率的影響 由圖4可知,料液比在1∶30～1∶50 (g/mL)范圍內,WP甜菜紅素的得率增大,料液比在1∶50～1∶70 (g/mL)范圍內,WP甜菜紅素得率下降;料液比在1∶10～1∶20 (g/mL)范圍內,RP甜菜紅素得率增大,料液比在1∶20～1∶50 (g/mL)范圍內,RP甜菜紅素得率下降。WP和RP甜菜紅素的得率最高的料液比分別是1∶50和1∶20 (g/mL)。可見料液比也是影響火龍果果皮甜菜紅素得率的重要因素之一。經綜合分析,WP料液比為1∶40、1∶50、1∶60 (g/mL),RP料液比為1∶10、1∶20、1∶30 (g/mL)作為正交試驗的3個水平。

圖4 料液比對火龍果果皮甜菜紅素提取的影響Fig.4 Effect of material to liquid ratio on the extraction of betalains from pitaya peel

2.2.1.3 超聲時間對火龍果果皮甜菜紅素得率的影響 由圖5可知,WP甜菜紅素得率在15～35 min時呈上升趨勢,在35 min時達到最大值,超聲時間大于35 min時,得率反而有小幅下降。而當超聲時間為5～10 min時,RP甜菜紅素得率上升,但超聲時間大于10 min時,其甜菜紅素得率呈下降趨勢。故選擇WP超聲時間為25、35、45 min,RP超聲時間5、10、15 min,作為正交試驗的3個水平。

圖5 超聲時間對火龍果果皮甜菜紅素提取的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction of betalains from pitaya peel

2.2.1.4 超聲溫度對火龍果果皮甜菜紅素得率的影響 由圖6可知,當超聲溫度在30～40 ℃范圍內時,兩個品種果皮甜菜紅素的得率均升高;當超聲溫度達到50 ℃時,WP甜菜紅素溶出最充分,而RP甜菜紅素提取效果最優的超聲溫度是40 ℃,超過50 ℃后,兩種火龍果果皮甜菜紅素的得率反而有所下降。故選擇超聲溫度為40、50、60 ℃;RP超聲溫度為30、40、50 ℃作為正交試驗的3個水平。

圖6 超聲溫度對火龍果果皮甜菜紅素提取的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of betalains from pitaya peel

2.2.2 正交試驗結果 在乙醇濃度、料液比、超聲溫度和超聲時間的4個因素的正交試驗中(表3～表4),由極差R值分析可知,影響WP甜菜紅素得率最大的因素為乙醇濃度,其次為提取溫度,再次為料液比,最后為提取時間。影響RP甜菜紅素得率最大的因素為料液比,其次為提取溫度,再次為乙醇濃度,最后為提取時間。WP甜菜紅素最佳提取組合為A2B1C1D1,即:乙醇濃度為40%,料液比為1∶40,超聲時間為25 min,超聲溫度為40 ℃;RP甜菜紅素最佳提取組合為A2B3C3D1,即:乙醇濃度為40%,料液比為1∶30,超聲時間為15 min,超聲溫度為30 ℃。以相同實驗方法,實施3次平行實驗,進一步驗證最佳工藝條件的可靠性,結果顯示WP和RP甜菜紅素得率分別為(0.856%±0.015%)和(0.915%±0.013%),理論值與實際值基本吻合,表明WP和RP甜菜紅素最佳提取組合分別為A2B1C1D1和A2B3C3D1。

表3 WP甜菜紅素提取工藝的正交試驗結果Table 3 The results of orthogonal experiment of the extraction technology of WP betalains

表4 RP甜菜紅素提取工藝的正交試驗結果Table 4 The results of orthogonal experiment of the extraction technology of RP betalains

2.3 火龍果果皮甜菜紅素含量的純化

經純化工藝流程獲得的果皮甜菜紅素提純物,WP甜菜紅素產量為1.25 g,得率為12.5%(即12.5 g/100 g干品);RP甜菜紅素產量為1.54 g,得率為15.4%(即15.4 g/100 g干品),表明兩種火龍果果皮甜菜紅素含量豐富,RP甜菜紅素產量是WP的1.232倍。

2.4 兩個品種火龍果果皮甜菜紅素抗氧化活性的比較

2.4.1 火龍果果皮甜菜紅素對DPPH·的清除能力 DPPH·在有機溶劑中是一種穩定的自由基,溶液在波長517 nm處有特征吸收峰,呈紫紅色[21]。自由基清除劑可與其單電子配對而使其吸收減弱,減弱程度與其所接受的電子數成定量關系,因此,可用分光光度法評價火龍果皮色素提取液對自由基的清除情況。圖7顯示,在一定樣品濃度范圍內,兩個品種火龍果果皮甜菜紅素對DPPH·有明顯的清除效果。當樣品濃度達2.5 mg/mL時,WP和RP甜菜紅素對DPPH·的清除率分別為85.00%和95.60%,對DPPH·的清除中,WP和RP甜菜紅素樣品濃度(x)與清除率(y)間的回歸方程分別為y=30.493x+15.059,R2=0.9701和y=33.286x+18.354,R2=0.9645?？梢?WP和RP甜菜紅素對DPPH·的IC50分別為1.15、0.95 mg/mL,表明兩種果皮甜菜紅素對DPPH·有明顯的清除效果,且RP甜菜紅素的清除效果優于WP,但低于等濃度的維生素C的清除能力。

圖7 兩種火龍果果皮甜菜紅素對DPPH·的清除能力Fig.7 DPPH· scavenging rates of betalains from two species of pitaya peel

2.4.2 火龍果果皮甜菜紅素對·OH的清除能力 ·OH的清除結果可通過Fenton反應產生自由基,其510 nm最大吸收峰消失,建立以OD510變化反映羥自由氧化作用的比色測定法,可評價火龍果果皮色素溶液對·OH 的清除能力[22]。圖8結果表明,在一定樣品濃度范圍內,兩種品種火龍果果皮甜菜紅素對·OH有明顯的清除效果。當樣品濃度為10 mg/mL時,WP和RP甜菜紅素對·OH的清除率分別為78.30%和94.90%。對羥自由基(·OH)清除中,WP和RP甜菜紅素樣品濃度(x)與清除率(y)間的回歸方程分別為y=7.2422x+6.9153,R2=0.9988和y=8.1208x+12.926,R2=0.9913,WP和RP甜菜紅素對·OH的IC50分別為5.95、4.57 mg/mL,表明在較低的樣品濃度下,兩種果皮甜菜紅素對·OH有明顯的清除效果,且RP甜菜紅素的清除效果優于WP甜菜紅素。

圖8 兩種火龍果果皮甜菜紅素對·OH的清除能力Fig.8 ·OH scavenging rates of betalains from two species of pitaya peel

圖9 兩種火龍果果皮甜菜紅素對亞硝酸根的清除能力Fig.9 Removal rate of nitrite of betalains from two species of pitaya peel

2.4.4 火龍果果皮甜菜紅素的總還原能力比較 圖10結果所示,試驗采用Oyaizu法,通過觀察添加不同濃度火龍果果皮甜菜紅素溶液后Fe3+和Fe2+之間的轉移來檢測樣品的還原能力?；瘕埞ぬ鸩思t素具有一定的總還原力,在試驗的質量濃度范圍,隨著樣品濃度的增加,吸光度增大,兩者呈劑量依賴關系,吸光度越高,還原能力越強,且RP甜菜紅素的總還原能力較優于WP甜菜紅素,但兩者略低于VC。WP和RP甜菜紅素樣品濃度(x)與清除率(y)間的回歸方程分別為y=0.2267x+0.0738,R2=0.9878和y=0.2305x+0.1562,R2=0.9794,顯示兩種火龍果果皮色素溶液有較強的總還原能力。

圖10 兩種火龍果果皮甜菜紅素的總還原力Fig.10 Total reducing power of betalains from two species of pitaya peel

3 結論

火龍果果皮富含甜菜紅素,是獲取安全無毒的天然紅色素重要來源,可廣泛應用于食品加工業、化妝品制造業等。經紫外可見光譜法和HPLC-MS/MS聯用法雙重驗證,兩種火龍果的果皮紅色素均為甜菜紅素。本文利用乙醇超聲波輔助提取法提取火龍果果皮甜菜紅素,通過單因素和正交試驗優化其提取工藝,綜合得出火龍果白肉紅皮品種果皮甜菜紅素的最佳提取工藝參數是:乙醇濃度40%,料液比1∶40 (g/mL),超聲時間25 min,超聲溫度40 ℃;紅肉紅皮品種果皮甜菜紅素最佳的提取工藝參數是:乙醇濃度40%,料液比1∶30 (g/mL),超聲時間15 min,超聲溫度30 ℃。最優條件下WP和RP甜菜紅素得率分別為(0.856%±0.015%)和(0.915%±0.013%)。與傳統的溶劑浸取法相比[23-24],乙醇超聲波輔助提取法可以很大程度上縮短生產周期,具有提高提取效率、節約溶劑等優點,而且果皮甜菜紅素提純物顏色艷麗,穩定性好。比較兩者最佳的提取工藝參數可知,RP以其純化工藝流程獲得的提純物產量是WP的1.232倍,色素得率更高。