蝦夷扇貝內臟源金屬硫蛋白的提取工藝優化

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(1.浙江省海洋水產研究所,浙江舟山 316021;2.浙江省海水增養殖重點實驗室,浙江舟山 316021;3.浙江海洋大學,浙江舟山 316021；4.中國水產科學研究院,北京 100141)

金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是一類廣泛存在于生物中的低分子質量(6～7 kDa)、高金屬含量、無芳香族氨基酸、富含半胱氨酸(20%～30%)的功能獨特的金屬結合蛋白[1]。金屬硫蛋白中大量巰基賦予了其螯合重金屬離子功能,從而具備重金屬解毒作用[2],MT清除自由基的能力明顯強于超氧化物歧化酶和谷胱甘肽,還可調節生物體內微量元素濃度,對細胞代謝的調節,細胞分化和增殖的控制以及在參與紫外(UV)誘導反應中都有重要作用,在食品、醫藥、保健、環境、化妝品、生物工程等領域中具有重要應用價值[3-4]。較多文獻報道了從兔肝、真菌、細菌及海藻中提取金屬硫蛋白[5-7],貝類中的研究較少。目前只能購買到國內市場上的兔肝源金屬硫蛋白,但其制備成本高,2018年市場價約為20萬元/克。蝦夷扇貝,濾食性雙殼貝類,是我國重要的養殖貝類之一。體內尤其是內臟團中易于富集重金屬[8]。工業中蝦夷扇貝的加工原材料多選用其閉殼肌,制成干制品或真空包裝食品,內臟作為下腳料,利用率低。金屬硫蛋白主要富集在金屬元素含量豐富的肝臟、腎臟等內臟器官中,因此蝦夷扇貝內臟可以作為提取金屬硫蛋白的良好原材料,同時獲得其純品并研究應用功能特性,推進金屬硫蛋白的廣泛使用意義重大。

本研究從蝦夷扇貝內臟中提取金屬硫蛋白,采用單因素和響應面法優化其提取條件,并對得到的粗提物進一步研究,致力于得到一種高效快速的提取方法及低成本金屬硫蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦夷扇貝 購買自大連劉清水產品旗艦店;分子篩預裝柱(Enrich SEC 70)(BIO-RAD);三羥甲基氨基甲烷(Tris) 生物試劑,北京索萊寶科技有限公司;5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB) 色譜純,上海安譜實驗科技股份有限公司;MT-I對照品、MT-II對照品 大連聯合博泰生物技術有限公司;乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉 均為優級純,國藥集團。

T18勻漿機 ULTRA-TURRAX;JXN-30高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特(Beckman Coulter Avanti);UV-3100BPC紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;微波消解儀 邁爾斯通(Milestone ETHOS A);7900電感耦合等離子體質譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司;全自動蛋白純化儀 美國伯樂(BIO-RAD)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理方法 鮮活蝦夷扇貝用過濾海水(過0.22 μm除去雜質)沖洗后,去殼,取其內臟團勻漿(轉速10000 r/min,每次3 min,重復三次),備用。

1.2.2 蝦夷扇貝內臟中金屬元素含量測定 取勻漿組織適量,按照現行國標方法[9],采用微波消解-電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS),測定蝦夷扇貝中Zn、Pb、Cd、Cu、As幾種元素含量。

1.2.3 蝦夷扇貝內臟中金屬硫蛋白提取 參閱相關文獻的提取方法并稍加修改[9-11]。取1.2.1中的勻漿組織適量,加入3倍體積(質量/體積)Tris-HCl提取劑(提取劑需提前配制,放置4 ℃預冷),同時加入1%三(2-羧乙基)膦(Tris-2-carboxyethyl-fosphine,TCEP)作為還原劑,加入Tris-HCl提取溶液后4 ℃提取約15 h,然后10000 r/min離心20 min,收集上清液加熱至一定溫度,除掉熱不穩定的大分子蛋白組分,冰水浴快速冷卻后4 ℃10000r/min離心20 min,收集上清液,加入3倍體積-20 ℃乙醇,4 ℃沉淀約15 h,最后4 ℃條件下將沉淀物分離,棄去上清液后加入10 mL Tris-HCl緩沖液,室溫下溶解3～4 h,溶液4 ℃再次10000 r/min離心20 min,收集上清液真空冷凍干燥后得到MT粗提物。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 Tris-HCl濃度對提取液中MT含量的影響 設定Tris-HCl的pH為8.0,加熱溫度為75 ℃,考察Tris-HCl濃度為0、0.01、0.02、0.03、0.04 mol/L時對提取液中MT含量的影響。

1.2.4.2 Tris-HCl pH對提取液中MT含量的影響 設定Tris-HCl的濃度為0.01 mol/L,加熱溫度為75 ℃,考察Tris-HCl提取劑pH為5、6、7、8、9時對提取液中MT含量的影響。

1.2.4.3 加熱溫度對提取液中MT含量的影響 設定Tris-HCl的濃度為0.01 mol/L,pH為8.0,考察加熱溫度為40、50、60、70、80 ℃時對提取液中MT含量的影響。

1.2.5 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上,利用響應面法優化MT的提取工藝,選取Tris-HCl的濃度、Tris-HCl pH和加熱溫度為考察因素,利用Box-Behnken模塊設計三因素三水平試驗,對提取條件進行優化,響應面設計實驗因素及水平見表1。

表1 響應面設計實驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.6 MT含量測定 選擇操作簡便,快速直觀的DTNB法測定樣品中MT含量。參閱文獻[12-14]中的方法并稍加改變。配制兔肝MT-I及MT-II混合對照品,濃度均為1 μg/μL。在試管中分別加入20、40、60、80、100、150 μL的MT標準溶液,加入10 μL 1.2 mol/L鹽酸溶液和200 μL 0.1 mol/L EDTA,置于暗處反應10 min脫去金屬,之后加入5 mmol/L DTNB試劑混勻3 min,使MT與DTNB形成黃色絡合物,用0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.25)稀釋至4 mL,在412 nm波長處測定顯色產物硫代硝基苯甲酸陰離子(TNBA)的量。樣品測定為加入1 mL樣品溶液,其他試劑同上。以兔肝MT-I及MT-II混合對照品濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程y=0.0172x-0.0061(R2=0.998),以此計算蝦夷扇貝內臟源MT粗提物的濃度。

1.2.7 MT分離純化方法 選用親水性聚甲基丙烯酸酯填料的分子篩預裝柱(Enrich SEC 70),將兔肝-金屬硫蛋白對照品MT-I和MT-II用超純水溶解,配制成濃度為1 mg/mL,然后稀釋到0.25 mg/mL,7000 r/min 離心5 min,過0.22 μm濾膜,取1 mL樣品注入樣品環中,利用全自動蛋白純化儀進行分子篩柱層析。流動相0.01 mol/L的Tris-HCl(pH8.25),流速0.5 mL/min。同時監測220、250、275 nm波長下流出液的信號值。流動相平衡2個柱體積后上樣,儀器連接自動收集器,每管收集3 mL。稱取適量蝦夷扇貝內臟源MT粗提物復溶,7000 r/min離心5 min,過0.22 μm濾膜后上機,其他條件同上。以保留時間定性,峰面積占比計算純度。

淖爾水質超標物主要有pH值、全鹽量、氯化物和硬度，鹽分處于主導地位。根據農田灌溉水質要求和滴灌工程設計要求，降低鹽分和抗堵塞是淖爾水質處理的關鍵。考慮灌溉的低成本和實效性要求，水源處以分凌水或引黃灌溉水與淖爾蓄水量按一定比例混合稀釋，以降低淖爾鹽分含量。首部采用泵前低壓網式過濾器+疊片過濾器組合模式，田間采用抗堵型內鑲貼片式灌水器可實現低成本高效過濾。

1.3 數據處理

所有實驗樣品做3個平行,運用Excel 2010版對單因素試驗數據進行處理,運用Design Expert 8.0.1軟件對Box-Behnken實驗進行設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 蝦夷扇貝內臟中金屬元素含量測定

根據ICP-MS測定的上機濃度及稱樣質量,計算出各金屬元素含量,具體數值見表2。由表2可知,在蝦夷扇貝內臟中,Zn>Cd>Cu>As>Pb。這一結果與文獻報道結果一致[15-16]。Zn、Cu是生物體生長所需的微量元素,但含量過高也會對生物體產生危害。Cd不是蝦夷扇貝生長所需元素,但含量居第二高,說明蝦夷扇貝對Cd具有一定的富集作用。

表2 蝦夷扇貝內臟中元素含量Table 2 The content of elements in Patinopecten yessoensis viscera

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取劑濃度對MT含量的影響 Tris-HCl緩沖液性質穩定,與生理體液的相容性好,且其與鈣、鎂離子不會形成沉淀,而且相同pH、相同濃度的Tris-HCl緩沖液的離子強度比其他鹽類緩沖液的離子強度低,這對蛋白類測定尤為重要,因為高離子強度容易使某些蛋白質降低活性甚至完全失去活性[17],所以選擇Tris-HCl作為提取劑。同時Tris-HCl緩沖液濃度與提取液中MT含量密切相關。由圖1可知,Tris-HCl濃度由0升至0.01 mol/L時,MT含量有增大的趨勢,但不明顯,Tris-HCl濃度由0.01升至0.03 mol/L時,MT含量緩慢下降,為更精確確定Tris-HCl濃度,響應面優化范圍設置為0.01～0.03 mol/L。

圖1 Tris-HCl濃度對MT含量影響Fig.1 The effect of concentration of extract on MT content

2.2.2 提取劑pH對MT含量的影響 Tris-HCl緩沖液pH受溫度影響大,一旦溫度改變,pH將發生變化,從而導致蛋白質活性改變,所以提取過程中盡量保持同一溫度。同時考察pH對其含量的影響。由圖2可知,提取劑pH由5升至7時,MT含量逐漸增大,但pH在7～9時,MT含量變化不明顯。根據文獻報道,水生生物金屬硫蛋白的等電點在3.5～6.0之間[11],為防止提取時金屬硫蛋白產生沉淀,Tris-HCl溶液的pH比等電點高一個單位左右,進一步參照相關文獻[7],MT提取劑多為堿性,為進一步精確確定pH范圍,綜合以上因素將響應面優化范圍設置為7.40～9.10。

圖2 Tris-HCl pH對MT含量影響Fig.2 The effect of pH on the content of MT

2.2.3 加熱溫度對MT含量的影響 MT本身具有一定的耐熱性,可利用這一特性除去多數熱不穩定蛋白質,進一步提高MT含量。由圖3可知,隨著溫度升高,MT含量呈現先升高后下降的趨勢,加熱溫度在60 ℃時MT含量最高。結合單因素結果及考慮MT的熱穩定性,同時為除去一些不耐熱的雜蛋白,因此,響應面實驗優化范圍設置為60～80 ℃。

圖3 加熱溫度對MT含量的影響Fig.3 The effect of heating temperature on the content of MT

2.4 響應面試驗

2.4.1 響應面模型與分析 根據單因素實驗結果設計響應面試驗因素水平,響應面實驗設計方案及結果如表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface design and results

表4 二次響應面回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

由方差分析可知,該模型的F=9.03,p=0.0042<0.01,表明實驗采用的二次模型是極顯著的[18],在統計學上是有意義的。模型的失擬項的F=4.64,p=0.0860>0.05,不顯著,說明該模型具有很好的擬合度。因素A Tris-HCl緩沖液濃度的p=0.0008<0.01,說明提取劑濃度對提取液中MT含量的影響是極顯著的(p<0.01),對于A2、B2其p值均小于0.01,說明C2的p值小于0.05,說明C2對提取液中MT含量的影響是顯著的(p<0.05),而B、C一次項及3個因素的二次交互項的影響均不顯著(p>0.05),結合F值可知,A、B及C三因素對MT含量的影響依次為:A(提取劑濃度)>C(加熱溫度)>B(提取劑pH)。

2.4.2 響應面優化 響應面是各因素對響應值影響結果構成的三維空間曲面圖,可直接反映各因素與響應值的交互作用。曲面越陡峭,對響應值的影響越大,而等高線形狀可反映因素交互作用的顯著程度[19-20]。響應曲面及等高線圖如圖4所示。從圖4可以看出響應面都為開口向下的凸形曲面,說明實驗存在提取液中MT含量的最大值。由圖4b等高線圖可知,A和B兩因素的等高線成橢圓形,沿A軸提取劑濃度的等高線較為密集,B軸提取劑pH的等高線較為稀疏,說明提取劑濃度對MT含量的影響比提取劑pH的影響大,3D曲面圖也可看出提取劑濃度的影響大于提取劑pH;圖4d中,B與C的等高線成圓形,說明B、C兩因素交互作用對MT含量的影響不顯著;由圖4f等高線圖可知,A和C兩因素的等高線成橢圓形,沿A軸提取劑濃度的等高線較為密集,沿C軸加熱溫度的等高線較為稀疏,說明提取劑濃度對MT含量的影響比加熱溫度的影響大,由3D圖可知提取劑濃度對MT含量的影響要高于加熱溫度。因此,結合等高線、3D圖及F值可知,三因素對MT含量的影響依次為:提取劑濃度>加熱溫度>提取劑pH。提取劑濃度與提取劑pH的響應面圖和提取劑濃度和加熱溫度的響應面圖都比較陡峭,說明它們的交互作用比較明顯,這與表4的回歸分析結果一致。

圖4 各因素交互作用對MT含量影響3D圖及等高線圖Fig.4 Response surface showing the effect of different factors on the total MT and contour

2.4.3 最優條件的優化與驗證 根據Design-expert 8.0.1軟件處理實驗數據所得結果,蝦夷扇貝內臟中金屬硫蛋白的最佳提取條件為,Tris-HCl提取劑濃度為0.01 mol/L,提取劑pH為8.23,加熱溫度為69.79 ℃,在此條件下,最佳響應結果為0.127 mg/g。實際實驗選擇為Tris-HCl提取劑濃度為0.01 mol/L,提取劑pH為8.23,加熱溫度為70 ℃,實際測得的MT含量為0.115 mg/g。因此響應面法得到的預期優化條件不僅準確可靠,而且具有實際價值。

2.5 MT分離純化

將兔肝-金屬硫蛋白混合對照品和蝦夷扇貝內臟源粗提物經分子篩柱層析后,同時監測3個波長下流出液的信號值,MT-I和MT-II混合對照品流出液及蝦夷扇貝內臟源粗提物均在λ=220 nm時響應值最大。對照品譜圖如圖5,按保留時間先后順序分別命名為MF1、MF2,蝦夷扇貝內臟源粗提物譜圖如圖6所示,按保留時間先后順序分別命名為Py1、Py2。由圖5、圖6可知,蝦夷扇貝內臟源粗提物中組分的保留時間與兔肝-金屬硫蛋白混合對照品的保留時間接近,且都在λ=220 nm響應值最高,據此可推測粗提液中組分即為蝦夷扇貝內臟源金屬硫蛋白2種異構體的混合物。MT與金屬結合而產生的特征吸收峰為:Zn-MT 220 nm,Cd-MT 250 nm,Cu-MT 275 nm,據吸收峰對MT進行分離鑒定[21-22]。而結合ICP-MS多元素測定結果,原材料中Zn含量明顯高于Cd、Cu的含量,兔肝源對照品結合的也是Zn,綜合以上因素可以推測提取到的MT類型為Zn-MT。由于MT-I和MT-II對照品分子量接近,所以在分子篩柱層析中較難分開。同理推測樣品中為金屬硫蛋白的2種異構體。對圖譜中各個峰積分后,按峰面積占比算得蝦夷扇貝內臟源粗提液中金屬硫蛋白的純度平均為81%。

圖5 兔肝金屬硫蛋白混合對照品圖譜Fig.5 Chromatogram of 2 kinds of MTs in standard solution

圖6 樣品圖譜Fig.6 Chromatogram of sample

3 討論與結論

通過單因素及響應面法優化提取條件,獲得了各因素的最佳值:Tris-HCl提取劑濃度為0.01 mol/L,提取劑pH為8.23,加熱溫度為70 ℃。在此條件下,實際實驗結果為0.115 mg/g,與模型預測的理論值基本相符。因此,本研究得到了從蝦夷扇貝內臟中提取金屬硫蛋白的有效方法。一步純化后,獲得2種異構體的金屬硫蛋白混合物,其純度約為81%。

目前關于金屬硫蛋白的研究已有多篇報道。Rubens T H等[23]經過一步親和色譜柱層析技術從亞馬遜大蓋巨脂魚和釀酒酵母中獲得了純度較高的金屬硫蛋白。Sandra S R等[24]通過HPLC-ICP-OES將貽貝中類金屬硫蛋白分離開,色譜柱類型為陰離子交換,流動相選用75 mmol/L Tris-HCl(pH7.4),流速0.8 mL/min。兩種類金屬硫蛋白在10 min內可分離開。Carolina L T-D等[14]從羅非魚的膽汁和肝臟中提取到了MT,采用響應面法優化了加熱溫度、2次離心時間及在提取劑中加入不同的還原劑等因素對MT得率的影響,采用分光光度法測定MT濃度,SDS-PAGE測定相對分子質量。上述研究成果均獲得了純度較高的金屬硫蛋白,本文研究結果與上述研究結果類似,獲得了2種類型MT的混合物。后續還需進一步將2種類型MT分離,獲得純品后還需進行結構鑒定。雖然關于金屬硫蛋白的研究成果已較多,但關于其結構鑒定方法卻鮮有報道。只有掌握蛋白結構才能全面了解其性質,從而為其充分廣泛的應用提供全面的理論知識。所以,對金屬硫蛋白結構的鑒定意義重大,今后也將在此領域進行深入研究。