響應面法優化超高壓處理提取金銀花綠原酸工藝

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(1.齊魯工業大學(山東省科學院),山東濟南 250000;2.山東上水農業發展股份有限公司,山東淄博 255000)

金銀花(又名雙花、忍冬花等)為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb)的干燥花蕾或初開的花,味甘、性涼,主肺、心、胃經,具有清熱解毒、疏風散熱的功效,可用于治療癰腫疔瘡、咽喉麻痹、丹毒、熱毒血痢、風熱傷風、溫熱退熱,藥用歷史悠久,有“中藥抗生素”之稱[1-2]。山東金銀花產量居全國首位,對金銀花進行深加工,豐富金銀花產品種類,提高產品的附加值,可以帶動當地經濟發展。

綠原酸是金銀花的主要藥用成分[3],具有清熱解毒和抗菌消炎作用[4],對消化道癌癥具有明顯的抑制作用,與人體血小板凝集和凝血因子的生成有關,還具有抗生育作用及對免疫系統的調節作用[5-6]。從金銀花中提取綠原酸多采用水提法、醇提法、微波提取法、超聲提取法等方法[8-9]。超高壓提取技術是利用以上的流體靜壓力作用于溶劑和植物物料的混合液,保壓幾分鐘后卸壓,隨后進行分離純化,從而達到提取的目的。超高壓提取技術具有提取得率高、耗時短、能耗低、提取液澄清、雜質含量少、常溫下操作,保護熱不穩定成分的活性、操作簡單等優勢。研究表明,超高壓提取法同超聲提取法、熱回流提取法進行比較,超高壓提取效果明顯優于超聲提取和熱回流提取。本實驗以金銀花為原料,采用超高壓處理金銀花,研究壓力、保壓時間、提取時間等因素對金銀花綠原酸得率的影響,提高金銀花綠原酸的得率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花 山東上水農業發展有限公司;蒸餾水、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯 均為分析純,濟南市三新俐華公司;綠原酸標準品 北京索萊寶科技有限公司。

QJ32W1000A型高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;AB135-S型電子分析天平 METTLER TOLEDO公司;RE111型旋轉蒸發儀 瑞士BBCHI公司;SHB-Ш循環水式真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;HPP/0.6L超高壓設備 天津華泰森淼生物技術有限公司;XMTD-8222型真空干燥箱 濟南龍瑞商貿有限公司;索氏抽提器 實驗室組裝。

圖1 超高壓設備及其結構圖Fig.1 UHV equipment and its structure

1.2 實驗方法

1.2.1 超高壓處理金銀花 將金銀花鮮花在真空干燥箱(90 ℃,12 h)中干燥,用粉碎機粉碎為粉末。取適量的金銀花粉末置于真空包裝袋中真空密封,再將真空袋置于超高壓設備中,設置壓力和保壓時間進行超高壓處理。

1.2.2 金銀花綠原酸的提取

1.2.2.1 綠原酸提取的工藝流程 金銀花粉碎→索氏抽提→抽濾→濃縮→冷沉離心→真空冷凍干燥

1.2.2.2 操作步驟 稱取經超高壓處理的金銀花粉末200.0 g,加入一定體積的一定濃度的乙醇浸泡12 h,用索氏提取器提取一定時間后,用真空抽濾裝置進行抽濾,將濾液用旋轉蒸發儀(40 ℃)減壓濃縮。將濃縮液轉移至分液漏斗中,加入適量的石油醚脫色處理2次,再用適量的乙酸乙酯萃取4次[7],以上步驟均取下層液體。將萃取液用旋轉蒸發儀減壓濃縮,得到的濃縮液冷沉離心(4000 r/min,5 min),將下層沉淀真空冷凍干燥(30 ℃,24 h)得到金銀花綠原酸提取物。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 提取壓力對金銀花綠原酸得率的影響 分別稱取金銀花粉末各200 g,置于真空袋中,設置壓力為100、200、300、400、500 MPa,保壓時間為10 min,超高壓處理完后,固定提取時間2 h,料液比1∶10 g/mL,乙醇濃度60%(乙醇與水的比例為6∶4,下文同),提取得到綠原酸。

1.2.3.2 保壓時間對金銀花綠原酸得率的影響 分別稱取金銀花粉末各200 g,置于真空袋中,設置保壓時間為5、7.5、10、12.5、15 min,壓力為300 MPa,超高壓處理完后,固定提取時間2 h,料液比1∶10 g/mL,乙醇濃度60%,提取得到綠原酸。

1.2.3.3 提取時間對金銀花綠原酸得率的影響 分別稱取金銀花粉末各200 g,置于真空袋中,設置壓力300 MPa,保壓時間10 min,超高壓處理完后,固定料液比1∶10 g/mL,乙醇濃度60%,分別對金銀花粉末進行提取1、1.5、2、2.5、3 h,得到綠原酸。

常壓下,料液比1∶10 g/mL,乙醇濃度60%的條件下,分別對金銀花粉末進行提取1、1.5、2、2.5、3 h,得到綠原酸。

1.2.3.4 液料比對金銀花綠原酸得率的影響 分別稱取200 g金銀花粉末,置于真空袋中,設置壓力300 MPa,保壓時間10 min,固定提取時間2 h,乙醇濃度60%,分別在料液比1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12、1∶15 g/mL的條件下提取得到綠原酸。

常壓下,固定提取時間2 h,乙醇濃度60%,分別在液料比1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12、1∶15 g/mL的條件下提取得到綠原酸。

1.2.3.5 乙醇濃度對金銀花綠原酸得率的影響 分別稱取200 g金銀花粉末,置于真空袋中,設置壓力300 MPa,保壓時間10 min,提取時間2 h,料液比1∶10 g/mL,分別用乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇對金銀花粉末進行提取,得到綠原酸。

常壓下,固定提取時間2 h,料液比1∶10 g/mL,分別用乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇對金銀花粉末進行提取,得到綠原酸。

實驗重復三次取平均值。

1.2.4 超高壓提取金銀花綠原酸的響應面工藝優化 在單因素實驗結果的基礎上,以提取壓力、保壓時間、提取時間、液料比和乙醇濃度為考察變量,采用Box-Behnken試驗設計方案,采用五因素三水平對工藝條件進行優化[10]。

1.2.5 金銀花綠原酸含量的測定

1.2.5.1 標準曲線的繪制 稱取綠原酸標準品10 mg,用無水乙醇溶解,定容至100 mL,分別取0、1、2、3、4、5、6 mL于7個25 mL容量瓶中,用無水乙醇定容。分別用分光光度計在330 nm處測吸光度。并以吸光度為縱坐標,綠原酸標準品質量濃度為橫坐標繪制標準曲線[8-9]。

1.2.5.2 金銀花綠原酸含量的測定 稱取提取的綠原酸樣品1 mg,用適量無水乙醇溶解,定容至25 mL,搖勻靜置。用分光光度計在330 nm處測吸光值,計算綠原酸的含量及得率。

綠原酸得率(%)=根據標準曲線測得的含量/原金銀花質量×100

1.3 數據處理

采用Origin 8 Pro SR4軟件和Design-Expert軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取壓力對金銀花綠原酸得率的影響 從圖2可以看出,隨著提取壓力的增加,金銀花綠原酸的得率呈現先增大后減小的趨勢,在提取壓力為300 MPa時,得率達到最大值。這是由于金銀花細胞在超高壓條件下,細胞內外的巨大壓力差會破壞細胞結構,提高有效成分的滲透速率和溶劑的擴散動力,從而使金銀花綠原酸得率提高。但當壓力超過300 MPa時,由于壓力差過大,促使金銀花細胞中的其他大分子物質滲透出(如蛋白質、色素等)造成溶質通道的堵塞,影響了金銀花的提取效果,降低了金銀花綠原酸的得率。因此,最適提取壓力選擇為300 MPa。

圖2 提取壓力對金銀花綠原酸得率的影響Fig.2 Effect of extraction pressure on the yield of honeysuckle chlorogenic acid

2.1.2 保壓時間對金銀花綠原酸得率的影響 從圖3可以看出,保壓時間在5～10 min時,金銀花綠原酸的得率隨著保壓時間的增加而升高;當保壓時間超過10 min后,得率基本保持不變。這是由于在巨大的壓力下,金銀花細胞內的有效成分的滲透速率和溶劑的傳質速率迅速增加,當達到平衡后,滲透速率和傳質速率不再增加,所以繼續增加保壓時間,金銀花綠原酸的得率基本保持不變。因此,最適保壓時間選擇為10 min。

圖3 保壓時間對金銀花綠原酸得率的影響Fig.3 Effect of holding time on the yield of honeysuckle chlorogenic acid

2.1.3 提取時間對金銀花綠原酸得率的影響 從圖4可以看出,提取時間在1～2 h時,金銀花綠原酸的得率隨著保壓時間的增加而升高;當提取時間超過2 h時,得率基本保持不變。這是由于在提取開始時,隨著時間的增加,金銀花中的有效成分不斷擴散到溶劑中,當擴散達到平衡時,有效成分不再擴散,得率基本保持不變。所以繼續增加提取時間,金銀花綠原酸的得率基本保持不變。因此,最適提取時間選擇為2 h。

2.1.4 液料比對金銀花綠原酸得率的影響 從圖5可以看出,在加壓條件下,金銀花綠原酸的得率在料液比1∶5～1∶10 g/mL時,隨著料液比的增加而增大,料液比超過1∶10 g/mL時,綠原酸的得率基本保持不變。在常壓條件下,金銀花綠原酸的得率隨著料液比的增加而提高,但加壓條件下的提取率明顯高于常壓條件下的提取率。這是因為,隨著料液比的增加,金銀花細胞內有效成分的擴散速率不斷增加,到料液比增大到一定量時,綠原酸擴散速率達到平衡,不再增加,繼續增大料液比,傳質動力不再增加,綠原酸的得率不再增大,且會造成提取溶劑的浪費。因此,選擇1∶10 g/mL為最適料液比。

圖5 料液比對金銀花綠原酸得率的影響Fig.5 Effect of ratio of material to liquid on the yield of honeysuckle chlorogenic acid

2.1.5 乙醇濃度對金銀花綠原酸得率的影響 從圖6可以看出,在加壓條件下,在乙醇濃度小于60%時,金銀花綠原酸的得率隨著乙醇濃度的增加而增大,在乙醇濃度為60%時達到最大值,當乙醇濃度大于60%時,金銀花綠原酸的提取率呈下降趨勢。這是由于當乙醇濃度較大時,一些醇溶性雜質、色素、親脂性強的物質溶出量增加,這些成分與綠原酸競爭乙醇,從而導原綠原酸的得率降低。因此,選擇60%為最適乙醇濃度。

圖6 乙醇濃度對金銀花綠原酸得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on the yield of honeysuckle chlorogenic acid

由圖4～圖6可以明顯看出,加壓條件下金銀花綠原酸的得率明顯高于常壓下的得率,因此提取時需在加壓條件下進行。

2.2 響應面優化試驗

以金銀花綠原酸提取率為響應值,在單因素實驗的基礎上,選取對綠原酸得率有明顯影響的壓力、保壓時間、提取時間、料液比、乙醇濃度進行五因素三水平的響應面分析實驗。

表2 Box-Behnken中心組合試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken center combination test

將實驗數據用Design Expert軟件進行多元回歸擬合,得到以提取率為目標函數的回歸方程:

Y=4.87+0.38A+0.28B+0.17C+0.11D+0.18E+0.22AB+0.13AC+0.11AD+0.073AE+0.12BC+0.033BD-0.19BE+0.042CD+0.048CE+0.070DE-0.59A2-0.47B2-0.47C2-0.37D2-0.25E2

表3 精油提取率響應面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of essential oil extraction rate response surface regression model

根據回歸方程作出相應等高線及其曲面圖(見圖7),列出的圖為對綠原酸得率影響顯著的因素的交互作用圖,考察所擬合的響應曲面的形狀,分析各因素對綠原酸得率的影響。由圖7可知,壓力與保壓時間交互作用響應面圖和等高線圖中,曲線較陡,說明提取壓力與保壓時間交互作用顯著,而保壓時間與乙醇濃度交互作用的響應面圖和等高線圖曲線相對平緩,對綠原酸得率影響的顯著性次之,且圖中的等高線均為橢圓形,表明其交互作用顯著,這與回歸方程的各項方差分析結果一致[11-13]。

圖7 各因素交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface map and contour map of interaction of various factors

2.3 最佳配方與模型驗證

根據三維響應圖可以看出,利用Design-Expert軟件對配方進行優化,得到金銀花綠原酸的最佳提取條件為:提取壓力324.018 MPa,保壓時間10.573 min,提取時間2.082 h,料液比10.440 mg/L,乙醇濃度61.822%,得率預測值為5.090%。校正后最佳條件為:提取壓力325 MPa,保壓時間10 min,提取時間2 h,料液比1∶10 g/mL,乙醇濃度60%。根據此條件,驗證回歸模型的有效性,3次驗證實驗表明,實測得率平均值為4.872%±0.049%,與預測理論值僅相差0.43%,說明該模型的擬合程度較好,此回歸方程能較好的預測綜合評分,具有一定的指導意義。

3 結論

各因素對金銀花綠原酸得率影響的次序為:提取壓力>保壓時間>乙醇濃度>提取時間>料液比。金銀花綠原酸提取的最佳條件為:壓力325 MPa,保壓時間10 min,提取時間2 h,料液比1∶10 g/mL,乙醇濃度60%。在此條件下,綠原酸得率為4.872%±0.049%。實驗證明,超高壓處理能夠提高綠原酸的得率。