HPLCUV法測定植物甾醇中3種甾醇單體的含量

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(1.江南大學食品學院,國家功能食品工程技術研究中心,江蘇無錫 214122; 2.江蘇科鼐生物制品有限公司,江蘇泰興 225400)

植物甾醇是一種以環戊烷全氫菲為基本骨架的天然活性化合物[1],通常包括菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇等,其中豆甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇在植物中含量最高,其結構通式見圖1。植物甾醇作為植物中的活性成分之一,廣泛存在于各類植物種子、堅果和植物油中,具有降低機體膽固醇水平、降低心臟疾病風險、抗癌、消炎和抗氧化等生理功能[2-4]。1999年FDA批準了植物甾醇及其酯類使用“健康聲稱”標簽[5],2004年植物甾醇經歐盟獲批在特定食品中使用[6],2010年我國衛生部正式批準并認證植物甾醇為新資源食品。目前,分離純化植物甾醇的原料來源主要是植物油脫臭餾出物和妥爾油[7]。近年來,植物甾醇在食品、醫藥和化工等領域受到廣泛關注與高度重視,全球植物甾醇的需求量呈逐年遞增的趨勢[8]。因此,建立一種靈敏準確、快捷簡便的檢測方法來測定植物甾醇的含量,對分析此類活性物質具有重要意義。

圖1 植物甾醇及甾醇單體的分子結構式Fig.1 Molecular structural formula of phytosterol and corresponding individual sterol

植物甾醇的檢測主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)和液相質譜聯用等方法[9]。薄層色譜法主要用于定性分析,在甾醇單體的定量方面存在靈敏度差、操作繁瑣和顯色不穩定等缺陷,使植物甾醇無法達到準確定量分析的要求[10];氣相色譜法或氣質聯用技術雖分辨率較高,且熱穩定性好,但缺點在于GC需要BSTFA+TMCS等硅烷化試劑對樣品進行衍生化預處理,試劑毒性大且檢測成本高,較高的操作溫度會在測量過程中破壞樣品分子結構[11-12]。目前,液相質譜聯用技術(HPLC-MS)作為一種靈敏度更高且選擇性更強的檢測手段,正在為植物甾醇的檢測提供一種新的可能[13-15],但HPLC-MS儀器設備購置及維護成本高昂,對操作人員要求較高,且分析繁瑣[16]。高效液相色譜法只需皂化和萃取等手段,從目標物中分離純化得到植物甾醇后即可直接進樣,無需對樣品進行衍生化,且能與蒸發光散射檢測器(evaporative light scattering detector,ELSD)、紫外可見光檢測器(ultraviolet detector,UV)等檢測器聯用,其中紫外檢測器作為最常用的檢測器之一,具有靈敏度高,準確度高、穩定性好等優點[17-18],由于菜油甾醇和豆甾醇只在C-22位和C-24位上存在結構差異,兩者之間產生的極性中和效應,使大多流動相溶劑、洗脫時無法消除其共洗脫效應。Zhang等[19-20]采用乙腈:異丙醇:水配比作為流動相,豆甾醇和菜油甾醇共洗脫,以同一個色譜峰的形式被檢出;Sanchez-Machado等[21]將乙腈和甲醇按一定比例作為流動相進行HPLC檢測,結果發現豆甾醇和菜油甾醇產生共洗脫效應,仍無法較好地分離。

本研究采用紫外高效液相法(HPLC-UV),針對市售的不同種類混合植物甾醇,建立一種準確可靠的分析方法。本文通過優化流動相配比、柱溫和流速等液相色譜條件,使菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇達到基線分離,并對檢測方法的線性關系、檢出限、定量限、精密度和回收率等方法學考察指標進行探究,采用HPLC-UV法可作為植物甾醇快速定量分析的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆甾醇(大豆油脫臭餾出物深加工產物) 源于江蘇泰州、福建龍巖、浙江蘭溪;木甾醇(妥爾油深加工產物,市售) 產自江蘇泰州;標準品豆甾醇、β-谷甾醇(純度>95%) 購于Sigma-Aldrich公司;標準品菜油甾醇(純度>95%) 購于成都市普思生物科技股份有限公司;乙腈、甲醇(均為色譜純) 購自百靈威科技有限公司;95%乙醇等其他試劑及藥品(均為分析純) 購自國藥集團化學試劑有限公司。

EL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器有限公司;KH-250DB數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司;RT10多點磁力攪拌器 德國IKA公司;QGC-12T氮氣吹干儀 上海泉島公司;循環水多用真空泵 上海瀘西分析儀器有限公司;Waters 1525高效液相色譜儀(HPLC-UV) Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制及標準曲線的繪制 分別準確稱量10 mg豆甾醇、10 mgβ-谷甾醇、5 mg菜油甾醇標準品,置于10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容,得混合標準儲備液。準確吸取混合標準儲備液50、100、200、400、800、1000 μL,將甲醇用氮吹儀吹干后,再用乙腈溶解,分別于10.0 mL容量瓶中,乙腈定容至刻度線,得到濃度為5、10、20、40、80、100 μg/mL的豆甾醇和β-谷甾醇標準系列溶液,濃度為2.5、5、10、20、40、50 μg/mL的菜油甾醇標準系列溶液。所有的標準溶液置于棕色容量瓶內,4 ℃保存,用于HPLC色譜分析。豆甾醇和β-谷甾醇標準曲線的濃度范圍為5～100 μg/mL之間,菜油甾醇標準曲線的濃度范圍為2.5～50 μg/mL之間。以3種甾醇單體的質量濃度為橫坐標,峰面積積分值為縱坐標,進行回歸分析,得到回歸方程以及相關系數。

1.2.2 HPLC色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry? C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);Waters 2489紫外可見光檢測器,檢測波長208 nm;等度洗脫;進樣量20 μL;外標法定量。本實驗考察100%甲醇、100%乙腈作為流動相、流動相中添加不同比例水(2%、4%、6%、8%、10%)、不同柱溫(25～40 ℃)、不同流速(0.5～1.5 mL/min)對3種植物甾醇單體的分離效果。

1.2.3 回收率和精密度 取均一的大豆甾醇樣品,分為3組,分別將10、20、40 μg的菜油甾醇、20、40、80 μg的豆甾醇和20、40、80 μg的β-谷甾醇添加進菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的本底值分別為47、47、81 μg的大豆甾醇樣品中,構成高、中、低3個加標組及1個空白對照組,重復測定5次,其中加標試驗組測得量減去未加標試驗組本底值所得結果與加標試驗組的理論加標量之比即為樣品回收率。取回收率實驗中高、中、低3個加標組在同一天內重復進樣5次,計算日內精密度;在連續3 d內每天重復進樣3次,計算日間精密度,均以RSD表示[22]。

1.2.4 樣品測定 取3種不同產地大豆甾醇和1種木甾醇,分別稱取10 mg,置于100 mL容量瓶中,以乙腈為溶劑并在常溫下超聲使溶解定容,每批做3組平行,按照1.2.2所述色譜條件下進樣測定,根據1.2.1給出的菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的標準曲線,按外標法計算3種甾醇單體的含量。

1.3 數據處理

所有實驗重復3～5次,數據計算均在Microsoft Excel 2013中完成。

2 結果與討論

2.1 HPLC-UV色譜條件的優化結果

其中以100%甲醇為流動相時,3種甾醇單體無法有效分離并以一個色譜峰的形式在保留時間10 min時出峰;而以100%乙腈為流動相時,β-谷甾醇能較好地分離出來,豆甾醇和菜油甾醇雖能以兩個色譜峰的形式出峰,但分離度低且兩峰無法達到基線分離,這是由于反相柱中溶劑的洗脫能力隨樣品極性的增強而減弱,甲醇的極性強于乙腈[21],故采用洗脫能力更強的乙腈更利于豆甾醇和菜油甾醇的分離。通過添加不同比例水來調節流動相的極性,最終發現乙腈∶水比例為98∶2時,豆甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇均能較好地分離且達到基線分離。

流動相確定后,為使3種甾醇單體達到最佳的分離度，對柱溫及流速進行了優化。25、30 ℃時色譜峰的峰寬較大,分離度較高,但檢測時間過長,且25 ℃色譜峰甚至出現拖尾現象;40 ℃時色譜峰峰寬較小,豆甾醇和菜油甾醇分離效果不好;30 ℃時色譜峰峰形最佳,且檢測時間適中,因此選擇30 ℃為最佳柱溫。0.5 mL/min流速時,3種甾醇單體分離效果較好,但檢測時間將近50 min;1.5 mL/min時檢測時間縮短至30 min以內,但由于流速較快,甾醇單體在色譜柱內被更快地洗脫下來,豆甾醇和菜油甾醇的色譜峰之間分離度減低,無法達到較好的分離效果;1.0 mL/min時甾醇單體各組分分離效果最佳,且檢測時間約為38 min,所以選擇1.0 mL/min為最優流速。由圖2可知,菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇在1.2.2色譜條件下的保留時間分別為29.3、31.1、36.1 min,且均能夠達到基線分離,能夠較好地進行甾醇的定量分析。

圖2 植物甾醇混合標準樣品的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of phytosterol mixed standard sample注:1.菜油甾醇;2.豆甾醇;3.β-谷甾醇。

2.2 方法學考察結果

2.2.1 線性關系、檢出限和定量限 在選定的色譜分析條件下,對1.2.1中的混合標準系列溶液進行分析。表1給出了3種甾醇單體的線性關系、檢出限和定量限。3種甾醇均保持良好的線性關系,菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的線性范圍為2.52～50.30、5.08～101.60、5.10～102.00 μg/mL,線性相關系數達到0.9971～0.9991,能夠滿足定量分析的要求,檢出限和定量限分別由3倍和10倍信噪比得來,分別為2.5、8.3 μg/mL。

表1 3種甾醇單體的線性關系、檢出限及定量限(n=3)Table 1 Linearity and limit of detection and quantitation of 3 kinds of individual phytosterol(n=3)

2.2.2 日內精密度和日間精密度 在實驗方法條件下,大豆甾醇中的3種甾醇單體的日內精密度介于0.06%～3.06%,從低至高水平的日內精密度結果發現,隨著加標濃度的提升,日內精密度的RSD值也不斷上升,推測可能是目標物濃度的上升對色譜柱柱效或流動相對目標物的洗脫能力產生了一定的影響;日間精密度介于1.56%～6.61%,表明該方法對植物甾醇的測定具有良好的精密度。

表2 HPLC方法的日內精密度(n=5)和日間精密度(n=3)(%)Table 2 Intra-day(n=5)and inter-day(n=3)precision of HPLC method(%)

2.2.3 加標回收率 按1.2.2色譜條件進行測定,以進樣5次測定計算平均值,結果見表3。由表3可知,菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇的加樣回收率分別在92.74%～98.29%、99.66%～106.25%、93.87%～100.49%之間,RSD介于2.91%～3.57%,表明該方法具有較高的回收率,回收結果準確可靠。

表3 3種甾醇單體的加樣回收率(n=3)Tbale 3 Recovery of 3 kinds of individual phytosterol

2.2.4 樣品測定 大豆甾醇是以植物油精煉過程的脫臭餾出物為原料提取得到的,而木甾醇來源于造紙業副產物妥爾油,兩種原料均為植物甾醇的重要原料來源[23]。目前,國內企業多以大豆油精煉過程的脫臭餾出物為原料生產植物甾醇,即大豆甾醇;而以妥爾油為原料生產的植物甾醇,即木甾醇,國內企業涉及較少,但由于妥爾油來源廣泛且其植物甾醇含量較高,且國外早已將妥爾油作為植物甾醇提取的重要原料來源之一[23]。因此分別選取國內3種不同產地大豆甾醇和1種木甾醇進行檢測,對本檢測方法能否準確測定植物甾醇產品的含量及其對不同種類植物甾醇檢測的普遍適用性進行檢驗。

由表4可知,除產自福建龍巖的大豆甾醇中菜油甾醇和豆甾醇含量差異較大以外,其余兩產地大豆甾醇中菜油甾醇和豆甾醇含量均較為接近,而β-谷甾醇的含量較高,為307.15～432.45 mg/g;木甾醇主要是通過皂化、蒸餾、冷卻和結晶等工序從妥爾油中提取分離所得,木甾醇中豆甾醇含量非常低,僅小于5%,但β-谷甾醇在木甾醇中的含量最高,為(685.10±7.55) mg/g,其含量遠高于豆甾醇在大豆甾醇中的含量,說明在對混合甾醇的進一步精制和分離純化中,木甾醇更適于作為分離純化出高純度β-谷甾醇單體的原料,而大豆甾醇中3種甾醇單體則適用于多種甾醇單體的分離富集,以期獲得附加價值更高的甾醇單體。

表4 不同產地的混合甾醇中3種甾醇單體的含量(n=3)(mg/g)Table 4 Content of 3 kinds of individual phytosterol of mixed phytosterol from different regions(n=3)(mg/g)

3 結論

本研究建立了測定不同混合甾醇中3種甾醇單體的含量的方法。通過流動相優化實驗,確定了乙腈和水在98∶2的比例下等度洗脫,流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃的最佳色譜條件,不僅使3種甾醇單體在38 min內達到基線分離,且大大縮短了保留時間。經過檢測方法學的考察,菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的線性關系良好,相關系數r分別為0.9971、0.9989、0.9991,線性范圍分別為2.52～50.30、5.08～101.60、5.10～102.00 μg/mL;其中,日內精密度和日間精密度分別介于0.06%～3.06%和1.56%～6.61%之間,說明該方法精密度較高;同樣,回收率較高并介于92.74%～106.25%,本方法對4種植物甾醇中3種甾醇單體的含量進行檢測,發現其中大豆甾醇和木甾醇中3種甾醇單體的含量組成差異較大,木甾醇中β-谷甾醇含量為(685.10±7.55) mg/g,遠高于豆甾醇在大豆甾醇中的含量,因此木甾醇更適于作為高純度β-谷甾醇單體分離純化的原料。

綜上,本文建立了HPLC-UV法對混合甾醇中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的定量方法,具有靈敏度高、穩定性好和操作簡便等特點,能夠較好地展現出不同植物甾醇中3種甾醇單體的分布規律,滿足準確定量3種甾醇單體含量的檢測要求。