茶多酚提取與純化方法及其功能活性研究進展

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(1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025;3.貴州大學化學與化工學院,貴州貴陽 550025)

茶葉是以山茶科植物茶(Camelliasinensis(L)O.Kuntze)的芽、葉為原料制成的產品,它與咖啡、可可并稱世界上三大無酒精飲料。茶葉中含有豐富的功能性物質,如茶多酚、茶多糖、維生素及礦物質等[1],因此茶葉具有興奮、抗衰老、醒酒、助消化、利尿、抗癌變、殺菌和解毒等功效[2-7]。茶多酚(Tea Polyphenols,TP)是茶葉中酚類化合物及其衍生物的總稱,主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、表兒茶素(epicatechin,EC)及兒茶素(catechin,C)等[8]。研究表明,茶多酚具有廣泛的藥理作用,如減肥、抗氧化、抗衰老、降血脂、抗癌、抗骨質疏松、抗炎抑菌、抗放射損傷等[9-10]。目前,國內外常用的茶多酚提取方法主要有:溶劑提取法、超聲波提取法、微波提取法、酶提取法、超臨界萃取法等[11-15],茶多酚的純化方法主要有:樹脂吸附法、膜過濾法、離子沉淀法等[16-18]。本文簡要介紹了茶多酚的組成及其基本理化性質,并分析了茶多酚常用的提取方法、純化方法、生物活性等,以期為茶多酚資源的有效開發利用及深入研究提供理論參考。

1 茶多酚的組成及性質

茶多酚(Tea Polyphenols,TP)又名抗氧靈、維多酚、防哈靈,是茶葉中所含的一類多羥基類化合物,由大約30多種含酚基的物質組成,包括黃烷醇類(兒茶素類)、黃酮醇類(黃酮醇及其苷類)、黃酮類(花黃素)、羥基-4-黃烷醇類、花青素類、縮酚酸類和酚酸以及其他多酚類[19]。其中兒茶素在茶葉茶多酚中含量最高,其又稱為單寧、茶蹂酸、茶靴質,在茶葉干物質含量中占20%～35%。根據兒茶素分子結構特點可分為:表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表沒食兒子茶素沒食子酸酯(EGCG)4種主要物質[20],其結構式如圖1。

圖1 茶多酚中兒茶素單體結構式Fig.1 Structural formula of catechin monomer in tea polyphenols

在常溫下,茶多酚為淡黃至茶褐色略帶茶香的水溶液、粉狀固體或結晶,但是在提取過程中,茶多酚很容易發生氧化或者聚合反應,因此通常見到的茶多酚都呈淡黃色至褐色,帶有澀味,略帶茶香;茶多酚易溶解于水、乙醇、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等溶劑中,微溶于油脂中,不能溶解于苯及氯仿等有機溶劑中;耐熱性及耐酸性好,在pH達到2～7時較為穩定,但在pH>8和光照下易發生氧化聚合,可與鐵離子反應生成綠黑色化合物[21]。

2 茶多酚的提取方法

2.1 溶劑浸提法

溶劑浸提法是利用茶多酚在溶劑中溶解度不同來提取茶多酚的一種方法。茶多酚既可以溶解在水相中,又可以溶解于有機溶劑中,常用的有機溶劑有乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯等,但它不溶于氯仿、石油醚。該方法先用水或有機溶劑把茶多酚從茶葉中提取出來,然后用氯仿除去雜質,再用乙酸乙酯將茶多酚從水或有機溶劑提取物中分離出來,最后將乙酸乙酯回收,即得茶多酚粗品。目前采用溶劑浸提法提取茶多酚的各工藝中,主要在提取時所選擇的提取劑、料液比、提取時間、提取液的pH、溫度、提取次數等方面存在不同。溶劑浸提法提取茶多酚的工藝比較見表1。

表1 溶劑浸提法提取茶多酚的工藝比較Table 1 Comparison of process for extracting tea polyphenols by solvent extraction

溶劑浸提法提取茶多酚的優點是設備簡單、成本低廉、操作簡單;但提取時間較長、提取效率低、提取出的茶多酚容易被氧化、純度低,后期必須反復除雜、精制,所用溶劑量大,部分溶劑有毒性、不利于食品安全,因而不易被食品、醫藥等行業所接受。而且后期除雜、精制過程繁雜,常涉及乙酸乙酯萃取,操作過程易產生乳化,導致產率下降。因此,溶劑提取法提取茶多酚,還需在簡化除雜、精致工藝及提高提取率等方面加以改進。

2.2 超聲波提取法

茶多酚主要存在于茶葉細胞原生質體及液泡內,細胞壁阻礙了茶多酚從細胞內向外滲出。超聲波可與媒質產生相互作用,產生熱作用、機械作用和空穴作用,在一定程度上破壞細胞壁結構,使細胞內物質快速溢出[29-31]。再用傳統工藝從提取液中得到茶多酚,然后純化。工藝過程為:茶葉→溶劑提取→超聲波處理→分離→粗品茶多酚→純化。超聲波提取法提取茶多酚的工藝比較見表2。

表2 超聲波提取法提取茶多酚的工藝比較Table 2 Comparison of the process of extracting tea polyphenols by ultrasonic extraction

利用超聲波法提取茶多酚具有以下優點[37-39]:提取工藝流程比較簡單,溶劑回收率較高,提取溫度較溫和,避免茶多酚在長時間高溫下氧化的可能,提高了浸提效果,節約能源等。同時超聲波輔助提取操作簡便易行、能較好地保護茶多酚類成分的物理結構和生理活性。另外超聲波提取法避免了有害溶劑的使用,提取成本低,綜合經濟效益顯著,因此超聲波提取法具有良好的市場前景和推廣價值。

2.3 微波提取法

微波提取是指在微波場中,使用合適的溶劑從天然植物、動物組織、礦物等中提取分離各化學成分的技術方法[40]。微波提取的基本原理是:不同物質吸收微波的能力存在差異,在微波作用下,被作用基體物質的部分區域或萃取體系中的某些成分被選擇性加熱,使得被萃取物質與基體或體系分離,進入到微波吸收能力較差的萃取劑中[41]。微波提取技術具有加熱迅速、選擇性加熱、高效節能、易于控制、安全環保、伴隨產生生物效應等優點。微波提取法提取茶多酚的工藝比較見表3。

表3 微波提取法提取茶多酚的工藝比較Table 3 Comparison of the process of extracting tea polyphenols by microwave extraction

微波提取與傳統提取法相比大大縮短提取時間,減少茶多酚的氧化,因此可有效保護原料中的活性成分。該法以水或乙醇為溶劑,環境友好無污染,提取率高,節約了溶劑,大大提高了提取效率,避免使用有毒溶劑,產品安全。

2.4 酶提取法

近年來,利用酶法提取生物活性物質的報道越來越多,酶不僅具有專一性和高效性的特點,同時作用條件溫和,這樣有利于生物活性成分的保留,另外無生物毒性,無污染,符合安全食品、綠色工業的時代要求,因此越來越受到人們的關注。果膠酶、纖維素酶等可軟化或分解植物細胞壁,促進胞內成分流出,增加待提取物與提取劑接觸機會,有效提高待提取生物活性成分的提取率[45]。酶法提取還常與其他技術聯用,做到更快更高效地提取出生物活性物質。酶法提取茶多酚的工藝比較見表4。

表4 酶法提取茶多酚的工藝比較Table 4 Comparison of enzymatic extraction of tea polyphenols

在生物活性物質提取新技術中,添加酶可以有效地提高生物活性物質的得率,縮短提取時間。酶法提取的溶劑大多是水,避免了有機溶劑對人體的有害作用,可以安全有效地投入食品、保健、醫藥等方面的使用。該法在生物活性物質提取的應用中有著廣闊前景。

2.5 其他方法

除以上提取方法外,茶多酚的提取還有其他方法,比如:高陽等[15]以3種茶葉(綠茶、青茶、紅茶)為研究對象,利用復合酶進行預處理,并使用超臨界CO2技術萃取,通過單因素試驗確定最佳提取條件,結果表明,最佳條件為萃取溫度50 ℃、萃取壓力40 MPa、夾帶劑(70%的乙醇)用量10%、萃取時間2.0 h,3種茶多酚粗品得率分別為14.2%、14.4%、11.1%。此外,還有采用微波-超聲輔助雙水相體系對綠茶末中的茶多酚進行提取[50]、微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取綠茶中的茶多酚[43]、生石灰水沉淀法[51]等的相關報道。

綜上所述,原料不同導致提取率不同,不同提取方法得到的提取率不同。溶劑法提取設備簡單,操作簡單,成本低,但提取時間較長,提取效率低,提取出的茶多酚容易被氧化,所用溶劑量大,提取的茶多酚純度較低,甚至茶多酚中還伴有大量的雜質。超聲波提取法提取工藝流程比較簡單,溶劑回收率較高,提取溫度較溫和,減少浸提時間,避免茶多酚長時間在高溫下發生氧化,提高浸提效果,節約能源等。微波提取法大大縮短提取時間,茶多酚氧化減少,因此可有效保護原料中的活性成分。酶法提取有利于茶多酚活性成分的保留,同時縮短提取時間,且無生物毒性,無污染,符合食品安全、綠色工業的時代要求。

3 茶多酚的純化方法

通過以上提取方法提取得到的茶多酚含有色素、茶多糖、茶蛋白等雜質,不利于后續的研究,要想得到高純度的茶多酚,需要經過進一步的純化。目前,通常使用的純化方法有:樹脂吸附法、膜過濾法、離子沉淀法等。

3.1 樹脂吸附法

樹脂吸附法是利用樹脂對茶多酚的選擇性吸附作用,實現與其他成分的分離,從而達到純化茶多酚的目的。如牛志平等[16]以8種樹脂對茶葉提取液的吸附解吸效果,篩選出最適合茶多酚分離純化的CG-8樹脂,當茶多酚供試液濃度為10 mg/mL,水洗液(2BV),用70%乙醇(2.5BV)解吸,澄清度為70.90%時,得到的產品茶多酚含量為98%,產品得率為85.8%。張斌等[52]采用正交試驗確定了NKA-9樹脂對茶多酚吸附分離的最佳工藝,在此工藝條件下分離得到的茶多酚含量為58.7%,得率為14%。連志慶[53]采用樹脂LX-7吸附茶濃縮液的茶多酚,經過吸附分離,最后得到的茶多酚含量為91.35%,得率為9.65%。該方法工藝簡單,耗能少,無毒,因此為茶多酚在食品、醫藥等方面的應用提供安全保障,而且樹脂可以回收利用,符合環保發展理念。但該方法對樹脂質量、性能的要求比較苛刻,樹脂的成本較高,壽命較短,需要定期換新,因此只適合小規模試驗,不適宜大規模工業化生產。

3.2 膜過濾法

膜過濾法[54]是根據分子量的大小不同,在茶多酚分離純化中使溶液中的茶多酚等小分子選擇性地通過膜,一定程度上將茶多酚、咖啡堿等與蛋白質、果膠、可溶性淀粉等進行了分離,從而提高茶多酚的含量。袁林穎等[17]采用中空纖維膜超濾,大孔吸附樹脂分離純化茶多酚,低壓下抽真空干燥,得到純度高于95%、咖啡因含量低于1%的茶多酚。周義卉等[55]采用截留分子量為100 kDa的超濾膜來過濾速溶茶副產品,通過正交試驗確定其最優工藝為:樣液質量分數0.40%、溫度35 ℃、壓力0.138 MPa,在此條件下得到的茶多酚含量為48.73%,得率為40.75%。Chandini[56]等通過試驗優化處理,表明在料液濃度為0.6%,采用MF-450 nm過濾得到的濾液中茶多酚含量為76.3%。該方法操作簡單、方便,不需要有機溶劑和加熱處理,條件溫和,環境污染小,過濾得到的茶多酚活性較高。但膜易受外界雜質污染,過濾速度慢,此外膜的使用壽命是一個值得關注的問題。

3.3 離子沉淀法

離子沉淀法是根據茶多酚能與某些金屬離子(如Al3+、Ca2+、Mg2+等)形成絡合物而沉淀,從而將茶多酚從復雜的混合物中分離出來,達到純化的目的。余兆祥等[57]以Al3+和Zn2+為復合沉淀劑,對茶多酚初提液進行分離純化,結果茶多酚的提取率為10.4%,純度為96%。孫志棟等[58]采用金屬離子沉淀法對茶多酚進行分離純化,茶多酚的提取率為11%～30%,純度為96%。王凱博等[18]用硫酸鋁和硫酸鋅作為沉淀劑對茶多酚進行分離純化,得到的茶多酚純度為94.3%。李石敬敏等[59]以干燥綠茶粉末為原料,采用超聲-離子沉淀法提取茶多酚,得到的茶多酚純度最高可達99.80%。該方法選擇性強,工藝簡單,成本低,產品色澤好,水溶性好,產品純度高。但茶多酚在相轉化過程中容易被氧化,某些有毒金屬離子在產品中有殘留,對設備耐腐蝕性較高。

3.4 其他方法

除以上純化方法外,陳理等[60]利用高速逆流色譜法對茶多酚中兩種兒茶素進行了分離純化,最終得到了純度高達98%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)與沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)。此外,還有柱色譜法[61]、高效制備液相色譜[62]等方法已有報道。

4 茶多酚的生物活性研究

目前,國內外許多學者對茶多酚的關注主要在抗氧化作用、抗腫瘤作用、抗輻射作用和抗動脈粥樣硬化作用等方面。

4.1 抗氧化作用

茶多酚是一類含有多酚羥基的化學物質,結構中的羥基可提供活潑的氫從而使自由基滅活,因此具有較強的抗氧化活性。陳丹丹等[63]研究證明,茶多酚有著極強的羥自由基和DPPH自由基清除能力。王丹丹等[64]以帶魚為研究對象,研究不同質量濃度茶多酚對帶魚的抗氧化效果,結果表明經茶多酚處理后能夠有效減緩蛋白質、脂肪等氧化分解。馮麗琴等[65]研究茶多酚的體外抗氧化性,結果表明粗茶多酚和兒茶素單體對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基存在很強的清除作用。劉喚明等[66]研究表明,茶多酚對細胞氧化溶血和H2O2所致的氧化溶血有顯著的抑制作用。表明茶多酚可作為潛在天然抗氧化劑應用于食品和醫藥工業中。

4.2 抗腫瘤作用

大量試驗研究表明,茶多酚具有抗腫瘤的功效。對于機體而言,致癌因子多為人類身體內的代謝反應產生的自由基,如反應氮、氧自由基等,這類自由基會對DNA的功能、結構加以破壞,最后導致了細胞的突然變化、病變死亡等。而茶多酚是一種低毒、高效的自由基消除劑,對細胞的DNA斷裂可以起到非常好的抑制作用,可以阻斷氧化。石芳等[67]研究表明,多酚類化合物主要通過激活癌細胞的調控凋亡的基因,誘導癌細胞的凋亡。Helieh等[68]研究表明,茶多酚在400～800 mg/mL能夠誘導DNA片段化,并與劑量相關,高濃度的茶多酚(>800 mg/mL)能夠導致腫瘤細胞凋亡和細胞溶解。Sagara等[69]研究表明,茶多酚通過阻滯癌細胞血管生成進而影響癌細胞生長,從而對治療膀胱癌具有很好的療效。Hajiaghaalipour等[70]研究表明,白茶提取物通過激活Caspase-3,-8,-9而發揮抗腫瘤活性,在抗結腸癌細胞活性方面具有功效。Huang等[71]研究表明,茶多酚-錳和茶多酚均能誘導癌細胞凋亡,且茶多酚-錳誘導癌細胞凋亡的細胞凋亡率比茶多酚高出2倍以上。

4.3 抗輻射作用

茶多酚抗輻射作用是通過調節基因表達,清除自由基以及蛋白合成等途徑來完成的。Nair等[72]研究表明,在γ射線輻射前對白鼠進行灌服表兒茶素,可以防止由輻射引起的血液白細胞DNA裂解,從而起到抗輻射的作用。Peng等[73]利用小鼠研究茶多酚預防γ射線輻射損傷,結果表明,茶多酚灌服能夠防止輻射誘導的小鼠下頜腺細胞凋亡,減少活體受到的輻射傷害。趙文紅等[74]研究表明,茶多酚可以減少由于陽光紫外線所造成的皮膚損傷,對于紫外線所引發的光感性皮炎可起到抑制的作用,讓其所造成的突變降到最低。郭紹來等[75]采用60Coγ射線照射小鼠造成亞急性損傷模型,結果表明,50%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)具有明顯緩解輻射所造成的造血功能損傷和抗氧化作用。

4.4 抗動脈粥樣硬化作用

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)主要是以動脈壁上的脂質沉淀形成粥樣狀的病灶,以及纖維增生讓管壁變得沒有彈性所引發的,治療的意義在于抑制低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)的氧化修飾。在Xie等[76]研究表明,在尿酸刺激人臍靜脈內皮細胞建立的體外炎癥模型中,茶多酚EGCG預處理后,能通過Notch信號通路,顯著抑制血管內皮細胞中炎癥因子單核細胞趨化蛋白1、IL-6和TNF-α的分泌,減少炎癥因子對內皮細胞的損傷,進而起到防治心血管疾病的作用。李鴻飛等[77]通過建立動脈粥樣硬化兔模型,結果表明,茶多酚能夠抑制通過免疫調節機制抑制Ig G及Mφ在斑塊內表達,并具有一定的量效關系。

4.5 其他作用

除以上活性研究之外,有研究發現,茶多酚可顯著降低Ⅱ型糖尿病性脂肪肝模型大鼠肝臟中的甘油三酯,對胰島素抵抗具有改善作用[78]。鐘滿群等[79]研究表明,茶多酚能夠增加肥胖大鼠的血清活性,可以提高機體抗氧化能力,改善機體在低氧狀態以及應激狀態的炎癥反應,因此茶多酚具有減肥作用。陳陶等[80]研究表明,茶多酚在不降低疼痛治療效果的前提下,能有效改善小鼠腸蠕動預防嗎啡所致便秘。此外,茶多酚還可作為一種新型的農藥或植物生長促進劑在農業中使用,且對農作物有明顯的增產和抗病蟲害的作用[81-82]。

5 展望

近年來,伴隨著國內外學者對茶多酚研究的日益重視,茶多酚的許多生物活性及功能逐漸進入人們的視野,國內外學者在茶多酚的化學成分、提取方法、純化方法、抗氧化、抗腫瘤、抗粥樣硬化等方面做了大量的研究。但是由于茶多酚本身化學成分的復雜性和生物功能的多樣性,有必要借助先進的儀器設備對茶多酚化學成分進行進一步的鑒定研究,對化學成分與生物活性之間的聯系也需要進一步研究。目前茶多酚的各種提取方法大多采用單一提取方法,并且對提取后得到的茶多酚沒有進一步分離純化,所以,得到的茶多酚的純度不高,同時得率也比較低,此外使用部分有機溶劑提取得到的產品存在潛在危害,不利于用于食品、醫藥行業。因此,對于茶多酚的提取,應該采用多種提取方法聯用,同時跟進對茶多酚的分離純化,這樣更有利于為茶多酚的工業化生產提供理論基礎。茶多酚在抗氧化、抗腫瘤、抗粥樣硬化等方面也倍受關注,但大多數研究僅限于實驗階段,還需進一步臨床試驗研究。

我國是茶葉種植大國,要想增加茶葉的附加值,對于茶多酚的提取工藝進行不斷完善是必要的,同時,在提取茶多酚的過程中,應不斷改進和完善茶多酚的穩定化技術,確保茶多酚的質量、活性,其應用前景將更加廣泛,將促進其在工業、食品和醫療領域的開發和利用。