電子自旋共振技術(shù)及其在食品脂質(zhì)氧化檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

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(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

電子自旋共振技術(shù)(electron spin resonance,ESR)作為一種檢測(cè)含未成對(duì)電子物質(zhì)結(jié)構(gòu)的光譜分析技術(shù),可提供分子中以未成對(duì)電子為中心的局部或整體的結(jié)構(gòu)信息[1]。該技術(shù)與傳統(tǒng)檢測(cè)物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的技術(shù)相比,具有特異性、直接性、靈敏性等特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用到生物醫(yī)藥[2]、考古鑒定[3]、環(huán)境勘測(cè)[4]等多個(gè)研究領(lǐng)域。基于ESR技術(shù)的諸多優(yōu)點(diǎn),其在食品檢測(cè)領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用,如利用ESR技術(shù)檢測(cè)食品中脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)生成的自由基[5]、蛋白質(zhì)主鏈和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)變化[6]、食品中某些成分與金屬離子的螯合作用[7]。

脂質(zhì)氧化是富含油脂的食品中常發(fā)生的一個(gè)復(fù)雜反應(yīng),其早期產(chǎn)物為不穩(wěn)定的含未成對(duì)電子的自由基,隨后自由基立即攻擊其他分子,結(jié)合成初級(jí)和次級(jí)氧化產(chǎn)物(不含未成對(duì)電子),這些氧化產(chǎn)物可影響食品的風(fēng)味、色澤、營(yíng)養(yǎng)等,甚至具有毒性或?yàn)槎拘晕镔|(zhì)的前體[8-9]。目前,已有許多技術(shù)手段應(yīng)用到脂質(zhì)氧化的檢測(cè)方面,包括光譜法、色譜法、產(chǎn)物量化法等[10-11]。但這些技術(shù)多為檢測(cè)初級(jí)或次級(jí)氧化產(chǎn)物的含量,不能敏銳的探測(cè)到氧化反應(yīng)精確的發(fā)生時(shí)間及早期的進(jìn)展程度。因此,尋找一種實(shí)時(shí)檢測(cè)、特異性強(qiáng)、靈敏度高的分析方法已成為人們關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。

ESR技術(shù)可對(duì)脂質(zhì)氧化反應(yīng)早期(尚未生成初級(jí)氧化產(chǎn)物)產(chǎn)生的含未成對(duì)電子的少數(shù)自由基進(jìn)行定性和定量分析。基于自旋捕獲法的ESR技術(shù)擴(kuò)展了其檢測(cè)范圍,可鑒定食品脂質(zhì)氧化早期產(chǎn)生的幾乎所有類(lèi)型的自由基。根據(jù)生成的ESR圖譜特征(如譜線(xiàn)的數(shù)目、峰高、峰面積)判定自由基的類(lèi)型和含量:當(dāng)生成一定形狀的吸收峰時(shí),表明樣品中存在自由基;峰越高或面積越大時(shí),表明樣品中的自由基含量越高,脂質(zhì)氧化反應(yīng)進(jìn)程中即將產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物就越多,脂質(zhì)氧化程度就越深。

本文擬綜述ESR技術(shù)的原理,ESR技術(shù)定性自由基時(shí)所引入的自旋捕獲法及自旋捕獲劑的選擇依據(jù),以及ESR技術(shù)定量自由基的多種方法。并著重論述ESR技術(shù)檢測(cè)畜禽肉制品、水產(chǎn)品、植物油脂、乳制品在加工、貯藏期間發(fā)生脂質(zhì)氧化反應(yīng)的程度。以期為富脂食品在實(shí)際生產(chǎn)、儲(chǔ)存過(guò)程中,控制脂質(zhì)氧化的發(fā)生,保持食品品質(zhì)及理化特性起到一定的指導(dǎo)意義。

1 ESR技術(shù)的原理

1.1 ESR技術(shù)設(shè)備組成

電子自旋共振譜儀[12]中四個(gè)必需的部件是微波源、檢測(cè)器、諧振腔和磁鐵,如圖1所示。諧振腔是盛放待測(cè)樣品的位置,諧振腔周?chē)拇盆F和微波源產(chǎn)生的外加磁場(chǎng)和電磁波是ESR發(fā)生的兩個(gè)基礎(chǔ)條件。樣品受到外加磁場(chǎng)和電磁波的刺激完成ESR的發(fā)生[13-14]。檢測(cè)器的作用是將光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào),經(jīng)放大器放大、計(jì)算機(jī)處理后得出數(shù)據(jù)。

圖1 電子自旋共振譜儀基本組成Fig.1 Electron spin resonance spectrometer basic composition

除主要部件外,針對(duì)不同樣品以及試驗(yàn)條件的要求,電子自旋共振譜儀可以配備其他部件,以滿(mǎn)足各種條件的需要,如變溫裝置、光照裝置等。例如,在物理學(xué)領(lǐng)域研究晶體結(jié)構(gòu)時(shí),配備變溫裝置可減少晶格的熱運(yùn)動(dòng),使譜線(xiàn)變窄,提高分辨率與檢測(cè)的精確度[12]。

1.2 ESR技術(shù)的檢測(cè)基礎(chǔ)

ESR技術(shù)的檢測(cè)基礎(chǔ)有兩個(gè)。第一:待測(cè)物質(zhì)需含未成對(duì)電子,即物質(zhì)分子中的原子核外層電子的個(gè)數(shù)為奇數(shù)。第二:需依靠未成對(duì)電子的自旋特性。原子核外層電子在圍繞原子核做軌道運(yùn)動(dòng)的同時(shí)伴隨著自身的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng),稱(chēng)為電子的自旋運(yùn)動(dòng)[15]。帶負(fù)電的電子在旋轉(zhuǎn)的過(guò)程中,類(lèi)似一個(gè)小磁體,將產(chǎn)生磁場(chǎng),進(jìn)而產(chǎn)生自旋磁矩[13-14]。若原子核外層電子的個(gè)數(shù)為偶數(shù)(抗磁性),兩兩配對(duì)的電子產(chǎn)生的自旋磁矩抵消;若原子核外層電子的個(gè)數(shù)為奇數(shù),剩余的一個(gè)電子(即未成對(duì)電子)產(chǎn)生的自旋磁矩則是永久性的。這種未成對(duì)電子產(chǎn)生的永久性自旋磁矩為ESR的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)[16]。

1.3 ESR技術(shù)發(fā)生過(guò)程

參照?qǐng)D1～圖2,待測(cè)物質(zhì)置于諧振腔內(nèi),經(jīng)磁鐵產(chǎn)生的外加磁場(chǎng)(磁場(chǎng)強(qiáng)度為B0)掃描后,樣品中的未成對(duì)電子受到外加磁場(chǎng)的影響,位于原始能級(jí)①上的未成對(duì)電子(核自旋量子數(shù)S=1/2,對(duì)應(yīng)磁量子數(shù)MS=+1/2、-1/2)在做自旋運(yùn)動(dòng)時(shí),產(chǎn)生的自旋磁矩趨向于兩個(gè)不同方向,分別為能級(jí)②和③的方向[17-18]。又因MS=±1/2對(duì)應(yīng)的能量為E=±1/2gμBB0(μB為常數(shù)),能量差(ΔE=gμBB0)致使能級(jí)①發(fā)生分裂,分裂后的能級(jí)為圖2中的能級(jí)②和③。

若此時(shí)微波源產(chǎn)生的電磁波(頻率為υ,方向垂直于外加磁場(chǎng)的磁場(chǎng)方向)也到達(dá)諧振腔,未成對(duì)電子將吸收電磁波能量,在滿(mǎn)足hυ=ΔE=gμBB0(h、g均為常數(shù))的條件下,位于低能級(jí)②上的電子躍遷到高能級(jí)③,即發(fā)生受激躍遷,這就是電子自旋共振現(xiàn)象[19-20]。電子發(fā)生一次躍遷產(chǎn)生一個(gè)共振吸收信號(hào),經(jīng)過(guò)電子自旋共振譜儀的微分處理可以得到一條反映能量變化的吸收譜線(xiàn)(微分譜形式),見(jiàn)圖2中的譜線(xiàn)(a)。

圖2 外加磁場(chǎng)、電磁波、14N原子核對(duì)能級(jí)裂分的影響Fig.2 Effect of external magnetic field,electromagneticwave and 14N nucleus on the level spilt

2 ESR技術(shù)測(cè)定過(guò)程中的關(guān)鍵步驟

2.1 自旋捕獲法的引入

自旋捕獲法是將一種抗磁性物質(zhì)(稱(chēng)為自旋捕獲劑)加到反應(yīng)體系中,自旋捕獲劑會(huì)與自由基結(jié)合成相對(duì)穩(wěn)定的順磁性物質(zhì)(稱(chēng)為自旋加合物),能在ESR檢測(cè)時(shí)間內(nèi)被探測(cè)到信號(hào),再根據(jù)生成的ESR圖譜特征得出自由基的類(lèi)型及含量[22-23]。因此,利用ESR技術(shù)結(jié)合自旋捕獲法可對(duì)食品在加工或貯藏過(guò)程中脂質(zhì)氧化反應(yīng)早期(初級(jí)氧化產(chǎn)物生成前)產(chǎn)生的自由基進(jìn)行定性和定量分析,通過(guò)早期生成自由基含量的多少評(píng)估脂質(zhì)氧化的程度。

2.2 自旋捕獲劑的作用機(jī)制與選擇依據(jù)

在實(shí)際試驗(yàn)中,先利用自旋捕獲法捕獲自由基,再通過(guò)ESR技術(shù)對(duì)捕獲的自由基進(jìn)行定性和定量分析。自旋捕獲法中用到的自旋捕獲劑種類(lèi)多且化學(xué)結(jié)構(gòu)不同,但通常為氮氧化合物。如圖2所示,當(dāng)自由基中的未成對(duì)電子遇到自旋捕獲劑的中心14N原子核時(shí),位于能級(jí)②、③上的電子在外加磁場(chǎng)、電磁波、14N(核自旋量子數(shù)I=1,對(duì)應(yīng)磁量子數(shù)MI=+1、0、-1)產(chǎn)生的磁場(chǎng)的共同作用下(原理同1.3),能級(jí)②、③繼續(xù)分裂,分裂后的能級(jí)分別為圖中的能級(jí)④～⑥和能級(jí)⑦～⑨。根據(jù)能級(jí)躍遷規(guī)則,低能級(jí)(能級(jí)⑦～⑨)上的電子共發(fā)生三次躍遷,經(jīng)電子自旋共振譜儀處理后得到3條譜線(xiàn),見(jiàn)譜線(xiàn)(b)。

常見(jiàn)的自旋捕獲劑有三大類(lèi),分別為亞硝基化合物、環(huán)狀硝酮和線(xiàn)性硝酮。表1為食品檢測(cè)中常用的幾種自旋捕獲劑,由結(jié)構(gòu)式可知,各自旋捕獲劑由1H、14N、12C、16O組成。其中1H、14N的核自旋量子數(shù)I≠0(能產(chǎn)生磁場(chǎng)),可與未成對(duì)電子發(fā)生圖2中的作用;而12C、16O的I=0(不能產(chǎn)生磁場(chǎng)),故無(wú)法與未成對(duì)電子相互作用。由于各自旋捕獲劑中1H、14N原子核的數(shù)目、中心1H、14N原子核的連接價(jià)鍵、周?chē)渌雍朔N類(lèi)的不同,二者與未成對(duì)電子的作用程度不同,即未成對(duì)電子吸收1H、14N原子核產(chǎn)生的磁場(chǎng)能量不同,故產(chǎn)生的譜線(xiàn)數(shù)目(與1H、14N的數(shù)目有關(guān))和形狀(高度和寬窄,與吸收能量大小有關(guān))也不同。因此不同自旋捕獲劑與自由基結(jié)合后生成的ESR圖譜特征(譜線(xiàn)數(shù)目、高度、寬窄)不同。

表1 自旋捕獲劑的分類(lèi)Table 1 Classification of spin trap

2.2.1 亞硝基化合物自旋捕獲劑 亞硝基化合物包括MNP(2-methyl-2-nitrosopane)、NOB(nitrosobenzene)和TTBNB(2,4,6-tri-tert-butylnitrosobenzene),自由基可以進(jìn)攻該類(lèi)自旋捕獲劑的中心14N,發(fā)生加成反應(yīng)生成自旋加合物,獲得自由基的結(jié)構(gòu)信息更完整。但是生成的自旋加合物對(duì)光、熱較敏感,因此不適合捕獲以氧為中心的自由基。

2.2.3 線(xiàn)性硝酮類(lèi)自旋捕獲劑 常用的線(xiàn)性硝酮類(lèi)自旋捕獲劑有POBN(α-(4-pyridyl N-oxide)-N-tert-butylnitrone)和PBN(phenyl-tert-butylnitrone)。POBN適合捕獲以碳為中心的自由基,PBN適合捕獲食品脂質(zhì)加熱后發(fā)生氧化產(chǎn)生的以氧為中心的自由基[24]。PBN合成簡(jiǎn)單、使用方便,對(duì)氧氣、光、熱較穩(wěn)定,易于保存。但PBN為脂溶性,不適合在水相狀態(tài)下參與反應(yīng),這限制了PBN在大多數(shù)反應(yīng)體系中的應(yīng)用[25]。另外,自由基是與PBN中心14N相鄰的12C結(jié)合,所以得到的結(jié)構(gòu)信息較少。而且,PBN與多種自由基反應(yīng)后生成的ESR圖譜特征相似,很難確定自由基的類(lèi)型。

2.3 ESR技術(shù)的定性方法

利用ESR技術(shù)鑒定捕獲的自由基類(lèi)型依靠的是電子自旋共振譜儀生成的ESR圖譜特征(吸收峰數(shù)目、高度、寬窄)。由前文中介紹的自旋捕獲劑的作用機(jī)制和各種自旋捕獲劑的化學(xué)性質(zhì)可知,自旋捕獲劑結(jié)構(gòu)中1H、14N的數(shù)目、周?chē)h(huán)境情況及捕獲的自由基的結(jié)構(gòu)決定了最終ESR圖譜特征。因此不同自旋捕獲劑與不同的自由基結(jié)合后,生成的ESR圖譜特征也不同。

表2 食品中常檢測(cè)的自由基類(lèi)型及其ESR圖譜特征Table 2 Free radical types often detected in foods and ESR spectral features

2.4 ESR技術(shù)的定量方法

2.4.1 峰高或峰面積 當(dāng)使用峰高和峰面積進(jìn)行定量分析時(shí),該方法的準(zhǔn)確性受儀器分離度的影響,其中峰面積對(duì)分離度的要求更高。當(dāng)分離度差時(shí),峰與峰之間的距離很小(峰較窄),此時(shí)使用峰面積進(jìn)行定量的誤差較大,適宜使用峰高進(jìn)行定量;當(dāng)分離度高時(shí),峰較寬,使用峰面積定量更準(zhǔn)確[27]。

若樣品中自由基含量越高,自由基完成ESR發(fā)生時(shí)吸收的能量則越多,產(chǎn)生的共振吸收越強(qiáng),峰高和峰面積越大,ESR信號(hào)強(qiáng)度越大;反之則否。此外,還有研究人員通過(guò)正負(fù)峰間幅值的大小反映ESR信號(hào)強(qiáng)度的大小,進(jìn)而反映自由基含量的多少[28-29]。也可利用峰高或峰面積與諧振腔內(nèi)樣品密度(g/cm)做歸一化處理(將有量綱的表達(dá)式變?yōu)闊o(wú)量綱表達(dá)式),使自由基絕對(duì)含量(有量綱)變?yōu)樽杂苫鄬?duì)含量(無(wú)量綱)[30]。經(jīng)過(guò)歸一化處理的數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確,不受進(jìn)樣量、操作條件的影響。

2.4.2 Q值 待測(cè)樣品置于諧振腔內(nèi),微波源和磁鐵產(chǎn)生的能量到達(dá)諧振腔后,樣品吸收能量發(fā)生能級(jí)分裂。諧振腔內(nèi)反映能量?jī)?chǔ)存和消耗情況用Q值(也稱(chēng)優(yōu)值)表示。Q值是一個(gè)周期內(nèi)空腔所儲(chǔ)存的電磁能的最大值乘以2πυ與單位時(shí)間空腔消耗的能量之比(空腔Q值以Q0表示)。若Q值越大,說(shuō)明未成對(duì)電子數(shù)量越多,吸收的能量越大,ESR信號(hào)強(qiáng)度越大[31-32]。

2.4.3 自旋總數(shù) 自旋總數(shù)是一種表示自由基含量的數(shù)值。在實(shí)際測(cè)定中,若不同待測(cè)樣品的性狀相似,ESR測(cè)定常數(shù)相同,那么標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測(cè)樣品的峰面積之比等于其自旋總數(shù)之比[22]。峰面積與自旋總數(shù)的關(guān)系為:

式中:A為ESR圖譜的峰面積;N為自旋總數(shù);?為約化后的普朗克常數(shù);T為溫度;h1為微波場(chǎng)的振幅;ω微波頻率;β、h、k、π為常數(shù)[22]。

3 ESR技術(shù)在檢測(cè)食品脂質(zhì)氧化程度中的應(yīng)用

肉制品、水產(chǎn)品、植物油料及乳制品富含脂質(zhì),在加工及貯藏過(guò)程中容易受自身脂肪酸組成、加工工藝、貯藏條件的影響,發(fā)生氧化反應(yīng)生成醛、酮、酯等各種小分子化合物。適度氧化對(duì)產(chǎn)品的良好風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。但過(guò)度脂質(zhì)氧化生成的初級(jí)和次級(jí)氧化產(chǎn)物卻能導(dǎo)致食品的色、香、味發(fā)生劣變[8]。

采用常規(guī)的檢測(cè)方法如直接測(cè)定脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的含量(氫過(guò)氧化物值(hydroperoxide,HPOD)、過(guò)氧化物值(peroxide numberperoxide value,POV)、共軛二烯和三烯、硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid value,TBARS))、光譜、色譜法等不能對(duì)各類(lèi)食品中脂質(zhì)的氧化程度進(jìn)行及時(shí)和精確的檢測(cè),且操作繁瑣。而ESR技術(shù)作為一種直接檢測(cè)自由基的技術(shù)手段,可以從分子結(jié)構(gòu)的角度出發(fā),準(zhǔn)確評(píng)定食品在加工及貯藏中脂質(zhì)早期的氧化程度,監(jiān)測(cè)其品質(zhì)變化,保持和改善制品的感官品質(zhì)。

3.1 ESR技術(shù)在檢測(cè)畜禽肉及其制品中脂質(zhì)氧化程度中的應(yīng)用

3.1.1 ESR技術(shù)在高壓誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化檢測(cè)中的應(yīng)用 畜禽肉制品由于富含蛋白質(zhì)、脂肪,某些加工工藝易促使脂質(zhì)氧化的發(fā)生。Alves等[30]通過(guò)ESR技術(shù)研究高壓處理對(duì)雞肉脂質(zhì)氧化的影響,發(fā)現(xiàn)隨著壓力的增加,雞肉中自由基相對(duì)含量增加了72.3%,表明高壓處理誘導(dǎo)了自由基生成,從而導(dǎo)致脂質(zhì)氧化的發(fā)生。Bolumar等[33]利用ESR技術(shù)探究了由高壓處理誘導(dǎo)的肉制品中脂質(zhì)氧化反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制,認(rèn)為較高的壓力破壞了肌纖維表面的雙層膜結(jié)構(gòu),增大了雙層膜內(nèi)酶、血紅素鐵、非血紅素鐵、金屬離子等促氧化成分與脂質(zhì)的接觸面積,從而誘導(dǎo)了脂質(zhì)氧化的發(fā)生。Bragagnolo等[34]通過(guò)ESR技術(shù)測(cè)得雞腿肉經(jīng)1000 MPa高壓處理5 min后,自旋總數(shù)由0.020增加至0.113,表明由POBN捕獲的脂質(zhì)類(lèi)自由基含量升高;但繼續(xù)延長(zhǎng)處理時(shí)間至30 min,樣品中的自由基含量與5 min組無(wú)顯著性差異(p>0.05)。試驗(yàn)表明,高壓誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化速度較快,因?yàn)殡S著處理壓力和時(shí)間的增加,自由基含量急劇升高;且短時(shí)間內(nèi)自由基含量即能增加到較高水平。

3.1.2 ESR技術(shù)在貯藏條件變化引起的脂質(zhì)氧化檢測(cè)中的應(yīng)用 由于光照、溫度、氧氣等貯藏條件的變化,肉制品中滋生的微生物在進(jìn)行正常的生理代謝時(shí),其體內(nèi)的脂肪氧合酶可誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化反應(yīng)的發(fā)生,導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)[35]。Miyagusku等[36]利用ESR技術(shù)測(cè)定雞肉在貯藏39 d內(nèi)的自由基含量的變化,結(jié)果表明,雞肉經(jīng)3.0 kGy的輻射處理后,微生物數(shù)量及自由基含量在整個(gè)貯藏期間均在可接受范圍內(nèi),可延長(zhǎng)保質(zhì)期22 d,且色澤、風(fēng)味等感官品質(zhì)良好。Chen等[37]利用PBN自旋捕獲劑結(jié)合ESR技術(shù)發(fā)現(xiàn),隨著貯藏期間牛肉反復(fù)凍融(牛肉先在-20 ℃中冷凍3 d,隨后在4 ℃中解凍20 h為1次凍融)次數(shù)的增加,ESR信號(hào)強(qiáng)度(由正負(fù)峰間幅值表示)由0.17增加到0.35,說(shuō)明后續(xù)過(guò)程中自由基攻擊其他分子生成的氧化產(chǎn)物越多,脂質(zhì)氧化程度越深。Jensen等[38]利用ESR技術(shù)發(fā)現(xiàn),貯藏期間的氧氣濃度對(duì)豬皮片的脂質(zhì)氧化具有重要影響,當(dāng)包裝材料的透氧率由0%增加至21%時(shí),樣品在貯藏25 w內(nèi)的自由基相對(duì)含量由44.0%增加到91.0%。

3.2 ESR技術(shù)在檢測(cè)水產(chǎn)制品中脂質(zhì)氧化程度中的應(yīng)用

3.2.1 ESR技術(shù)在熱處理誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化檢測(cè)中的應(yīng)用 熱處理是多數(shù)食品在加工中不可避免的一道工序,加熱會(huì)對(duì)食品中的許多成分產(chǎn)生不利的影響。趙雅娉等[22]利用ESR技術(shù)發(fā)現(xiàn)當(dāng)扇貝的加熱溫度由55 ℃上升至95 ℃時(shí),POBN捕獲的脂質(zhì)類(lèi)自由基的ESR信號(hào)強(qiáng)度(由峰高表示)由4.483×105上升至13.28×105。李楠等[39]利用ESR技術(shù)研究雜色蛤在95 ℃下加熱其脂質(zhì)類(lèi)自由基(POBN作為自旋捕獲劑)的生成量,隨著加熱時(shí)間由10 min延長(zhǎng)至5 h,ESR信號(hào)強(qiáng)度(由峰高表示)由0.50×105上升至9.44×105。這說(shuō)明熱處理的溫度越高或時(shí)間越長(zhǎng),產(chǎn)品中的自由基生成量越高,脂質(zhì)氧化越嚴(yán)重。

當(dāng)水產(chǎn)品的貯藏新鮮度越低時(shí),內(nèi)源性氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide,TMAO)更易受溫度和Fe2+的影響,發(fā)生脫烷基化作用生成甲醛、二甲胺、三甲胺這類(lèi)有害物質(zhì)。陳帥等[40]在體外模擬體系中利用ESR技術(shù)測(cè)得TMAO標(biāo)準(zhǔn)品在加熱條件下(100 ℃,15 min),Fe2+濃度由2 mmol/L增加到20 mmol/L時(shí),PBN捕獲的-(CH3)3N·自由基的ESR信號(hào)強(qiáng)度(由峰高表示)由3.00×105增加至1.75×106。Falch等[28]通過(guò)ESR技術(shù)觀察到,鮭魚(yú)內(nèi)臟油在40 ℃下加熱2 h即可探測(cè)到PBN自旋加合物信號(hào),ESR信號(hào)強(qiáng)度(由正負(fù)峰間幅值表示)由0增加至8.00×103。

3.2.2 ESR技術(shù)在輻射誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化檢測(cè)中的應(yīng)用 水產(chǎn)品在死后貯藏期間極易發(fā)生自溶現(xiàn)象。即由于溫度、光照(尤其是紫外線(xiàn))、氧氣等條件的變化使肌肉中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng),生成的自由基又可以反作用于脂質(zhì)或蛋白質(zhì),引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),造成細(xì)胞損傷、凋亡,釋放出組織蛋白酶,使肌肉發(fā)生溶解,甚至成為液態(tài),影響感官品質(zhì)與食用品質(zhì)[41-43]。Qi等[44]以海參體壁勻漿液模擬海參發(fā)生自溶現(xiàn)象后形成的溶液狀態(tài),對(duì)10 mg/mL的樣品進(jìn)行15 W/m2的紫外線(xiàn)處理,ESR圖譜顯示出典型的四重峰(強(qiáng)度比為1∶2∶2∶1)為DMPO捕獲的HO·,隨著紫外線(xiàn)處理時(shí)間由0 min增加到30 min,ESR信號(hào)強(qiáng)度(由峰高表示)逐漸增加,說(shuō)明自由基含量呈上升趨勢(shì)。Goulas等[45]利用ESR技術(shù)測(cè)得,隨著鯡魚(yú)骨樣品的輻射劑量逐漸增加至10 kGy,ESR信號(hào)強(qiáng)度(由正負(fù)峰間幅值表示)由-0.4～0.4范圍內(nèi)波動(dòng)升高至-1.6～1.6。試驗(yàn)表明,隨著輻射劑量和時(shí)間的增加,自由基生成量增加,這對(duì)產(chǎn)品的貯藏特性及食用安全性不利。

3.3 ESR技術(shù)在檢測(cè)油脂中脂質(zhì)氧化程度中的應(yīng)用

3.3.1 ESR技術(shù)在熱處理誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化檢測(cè)中的應(yīng)用 富含不飽和脂肪酸的植物油脂易在加工或貯藏期間中受溫度、氧氣、金屬離子等影響,發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生酸敗味甚至生成有毒物質(zhì)。油脂在升溫過(guò)程中伴隨著美拉德反應(yīng)的發(fā)生,并存在明顯的自由基變化[46-47]。劉玲等[29]通過(guò)ESR技術(shù)探究食品中的美拉德反應(yīng)體系(蛋白質(zhì)-葡萄糖體系)在70 ℃加熱條件下自由基的生成情況,POBN捕獲的自由基以L(fǎng)·和LO·為主,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),ESR信號(hào)強(qiáng)度(由正負(fù)峰間幅值表示)由1.3×104～1.7×104逐漸增加到1.1×104～2.0×104。姜壽浩[48]由ESR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),花生油分別在90 ℃和120 ℃下加熱150 min,以DMPO-·OL為主的自旋加合物的自旋總數(shù)范圍為2.25×1014～8.00×1014和6.00×1014～1.30×1015,表明加熱溫度越高、時(shí)間越長(zhǎng),油脂中LO·的生成量越高,油脂的氧化程度越高。

3.3.2 ESR技術(shù)在油脂成分變化引起的脂質(zhì)氧化檢測(cè)中的應(yīng)用 油脂中添加物的性質(zhì)和脂肪酸的組成可影響其氧化穩(wěn)定性[49]。Yi等[50]等通過(guò)ESR技術(shù)發(fā)現(xiàn)混合魚(yú)油樣品(黃棕櫚油∶魚(yú)油=4∶1)在60 ℃下的氧化穩(wěn)定性隨黃棕櫚油添加量的增加而提高,添加500 mg/kg的檸檬酸和200 mg/kg的抗壞血酸棕櫚酸酯,可進(jìn)一步將樣品中PBN捕獲的ESR信號(hào)強(qiáng)度(由正負(fù)峰間幅值表示)范圍由0.4～2.5降低至0.2～0.5。

在利用ESR檢測(cè)油脂氧化產(chǎn)生自由基的過(guò)程中,常用誘導(dǎo)時(shí)間評(píng)價(jià)油脂的氧化穩(wěn)定性[22]。誘導(dǎo)時(shí)間越長(zhǎng),表明自由基生成量增長(zhǎng)較慢,即油脂不易受加工或貯藏條件的變化而發(fā)生脂質(zhì)氧化,氧化穩(wěn)定性越高。Kozlowska等[51]利用ESR技術(shù)觀察葵花籽油在加熱(100 ℃)條件下的自由基生成趨勢(shì),添加了100 ppm的鼠尾草提取物,可將油脂的誘導(dǎo)時(shí)間由43 min提高至90 min,而等劑量的BHA僅能將誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)10 min。

除誘導(dǎo)時(shí)間外,自旋捕獲劑信號(hào)的消失速率也用于衡量自由基的生成量。自旋捕獲劑的消失速率越快,表明其與自由基反應(yīng)速率越快,樣品中自由基含量越高[52]。Raudsepp等[53]利用ESR技術(shù)測(cè)得試驗(yàn)組蛋黃醬(中鏈甘油三酯∶不飽和亞麻籽油=1∶4)在室溫貯藏過(guò)程中,TEMPO自旋捕獲劑的信號(hào)消失速率較對(duì)照組(由單一的中鏈甘油三酯或不飽和亞麻籽油制成的蛋黃醬)小1000～2000,即試驗(yàn)組的自由基生成量低。試驗(yàn)表明,混合油脂體系中脂肪酸組成的多樣化可影響產(chǎn)品的氧化穩(wěn)定性。

3.4 ESR技術(shù)在檢測(cè)乳制品中脂質(zhì)氧化程度中的應(yīng)用

3.4.1 ESR技術(shù)在熱處理誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化檢測(cè)中的應(yīng)用 熱處理是乳制品加工中最基本、常見(jiàn)的處理方法,如巴氏殺菌、噴霧干燥、真空濃縮等[54]。Li等[55]利用ESR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)熱處理后制成的奶粉在室溫中貯藏3～6個(gè)月內(nèi),ESR信號(hào)強(qiáng)度(由峰面積表示)由(2.99±0.59)×107增加到(1.23±0.19)×108。Cheng等[56]發(fā)現(xiàn),高脂(28 g/100 g)奶粉在70 ℃下貯藏1 h和20 d和25 ℃下貯藏18周的ESR信號(hào)強(qiáng)度(由峰面積表示)范圍分別為5.0×103～3.5×104、1.5×103～2.5×103,表明貯藏溫度越高、時(shí)間越長(zhǎng),奶粉中的自由基含量越高,脂質(zhì)更易發(fā)生氧化。經(jīng)證實(shí),乳制品中脂質(zhì)氧化反應(yīng)的發(fā)生與高水平的不飽和脂肪酸在熱條件下的過(guò)氧化有關(guān),產(chǎn)生的哈喇味嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的感官品質(zhì)[57]。

以上研究表明,溫度易促使乳制品中不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)。乳制品經(jīng)過(guò)熱處理后,即使后續(xù)貯藏期間的溫度較低,也會(huì)對(duì)產(chǎn)品的貯藏穩(wěn)定性產(chǎn)生不良影響。而且貯藏期間,溫度越高,時(shí)間越長(zhǎng),乳制品中的脂質(zhì)氧化反應(yīng)程度越深。

3.4.2 ESR技術(shù)在光照引起的脂質(zhì)氧化檢測(cè)中的應(yīng)用 乳制品中的核黃素、卟啉、葉綠素衍生物等光敏成分極易在光照下誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化并使?fàn)I養(yǎng)價(jià)值降低,而且環(huán)境中的氧濃度越高,氧化產(chǎn)生的影響更大[58]。Sattar等[59]報(bào)道波長(zhǎng)低于455 nm的光線(xiàn)即可誘導(dǎo)牛奶發(fā)生脂質(zhì)氧化。Westermann等[60]發(fā)現(xiàn),低脂(17 g/100 g)奶酪經(jīng)不同時(shí)間的紫外線(xiàn)處理后,生成的ESR圖譜中的譜線(xiàn)形狀發(fā)生變化,由1條寬峰變成由2條低峰和1條高、窄峰的組合。這表明TEMPO自旋捕獲劑與不同處理時(shí)間下的自由基結(jié)合后,生成的自旋加合物結(jié)構(gòu)不同,因此圖譜形狀發(fā)生改變。即隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),樣品中的自由基類(lèi)型發(fā)生了變化。通過(guò)研究圖(B)中的擬合圖譜(b)的形狀,發(fā)現(xiàn)80 min下生成的以氧為中心的自由基再經(jīng)過(guò)100 min處理后轉(zhuǎn)化為以氮為中心的自由基。Kristensen等[61]利用ESR技術(shù)探究發(fā)現(xiàn),奶酪在貯藏期間,經(jīng)2000 lx的日光照射,可使DMPO捕獲的HO·自由基相對(duì)含量增加了45.5%且增長(zhǎng)速度較快。

乳制品在低溫貯藏期間,光照是影響乳制品貯藏穩(wěn)定性的因素。研究者認(rèn)為乳制品若在加工、包裝、零售等過(guò)程中受到光線(xiàn)的照射,即使后期在黑暗的條件下貯藏依然會(huì)加速制品內(nèi)部脂質(zhì)氧化的發(fā)生,并且貯藏時(shí)間越長(zhǎng),由脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的自由基水平越高,對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)影響越大[62]。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

結(jié)合自旋捕獲法的電子自旋共振技術(shù)能對(duì)食品發(fā)生脂質(zhì)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的絕大多數(shù)自由基進(jìn)行定性和定量分析。可用于鑒定食品在加工、貯藏過(guò)程中,由于處理手段、條件等因素影響而發(fā)生脂質(zhì)氧化或其程度。電子自旋共振技術(shù)在食品中的應(yīng)用雖然較物理化學(xué)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域起步晚,但是憑借其操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、精確度高等優(yōu)點(diǎn),在食品脂質(zhì)氧化檢測(cè)方面有一定的應(yīng)用前景,然而現(xiàn)階段仍有一些障礙需要克服。

在ESR發(fā)生過(guò)程中,部分自旋捕獲劑與不同自由基結(jié)合生成的自旋加合物結(jié)構(gòu)類(lèi)似,因而最終生成的ESR圖譜特征相似,不易精確分辨出捕獲的自由基類(lèi)型,即定性分析受限。此外,某些自旋加合物對(duì)環(huán)境條件的變化敏感,容易衰變,可能某些特征基團(tuán)消失,利用ESR技術(shù)探測(cè)不到其完整信號(hào),即定性、定量分析受限。因此,未來(lái)需要尋找出更多性能優(yōu)良的自旋捕獲劑以供分析使用,同時(shí)也需要研究人員在使用自旋捕獲劑前,仔細(xì)衡量其利弊以選擇出最適的自旋捕獲劑,為獲得高質(zhì)量的ESR圖譜作基礎(chǔ)。

隨著電子自旋共振波譜儀設(shè)備的更新?lián)Q代及試驗(yàn)方法的完善,脈沖ESR、多頻共振ESR等技術(shù)已被用于待測(cè)樣品化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能的研究。納米級(jí)的脈沖ESR技術(shù)能檢測(cè)到瞬態(tài)順磁性的中間產(chǎn)物,即能檢測(cè)食品脂質(zhì)氧化發(fā)生過(guò)程中生成的部分不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物,擴(kuò)展了傳統(tǒng)ESR技術(shù)的研究范圍。