甘麥大棗湯加味對抑郁癥模型大鼠海馬-HPA軸的調節(jié)作用

張 晟 戴薇薇 張學禮 金國琴 夏花英 (上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院生物化學教研室，上海 201203)

邊緣系統(tǒng)與HPA軸的關系非常密切，如海馬可抑制HPA軸的活性，并參與該軸應激反應的抑制調節(jié)。本研究以孤養(yǎng)加慢性不可預見性中等刺激所致抑郁癥大鼠為模型，以西藥文拉法辛為對照，探討甘麥大棗湯加味對模型大鼠HPA軸及海馬的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 甘麥大棗湯加味由甘草、淮小麥、大棗、柴胡、郁金、知母等組成，中藥購于上海雷允上藥業(yè)有限公司。方藥制成煎劑，濃度為2.3 g生藥/ml，4℃冰箱保存，臨用稀釋。文拉法辛為成都大西南制藥股份有限公司產品(產品批號：050702)。主要試劑：Trizol試劑為Molecular Research Centre Inc.產品;RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒為Fermentas公司產品;促腎上腺皮質激素(ACTH)放免分析試劑盒為北京北方生物技術研究所產品;大鼠皮質酮(CORT)放免分析試劑盒為Diagnostic Systems Laboratories Inc.產品;GR引物(上游：5'-TGGACT CCA AAG AAT CCT TAG-3'，下游：5'-GAT ACA ATT TCA CAC TGC CTC-3'，擴增片段550 bp)、BDNF引物(上游：5'-CTT TTG TCT ATG CCC CTG CAG CCT T-3'，下游：5'-AGC CTC CTC TGC TCT TTC TGC TGG A-3'，擴增片段310 bp)、β-actin 引物(上游：5'-ATG GGC ACA GTG TGG GTG AC-3' ，下游：5'-TGA CGA GGC CCA GAG CAA GA-3'，擴增片段為330 bp)、GAPDH引物(上游：5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'，下游：5'-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3'，擴增片段為450 bp)均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 主要儀器 γ-計數(shù)器：中科日環(huán)有限公司(型號：SN682);紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司(型號：UV754N);高速低溫離心機：Eppendorf(型號：Centrifuge 5417R);高速組織搗碎器：Misonix Incorported(型號：XL2000-010);電子天平：上海精密科學儀器有限公司(型號：JA2003N);PCR擴增儀：美國PE公司(型號：9600);凝膠掃描及分析系統(tǒng)：上海復日科技有限公司(型號：FR-200);電泳儀：上海生化所西巴斯生物技術開發(fā)公司(型號：DY-A);電泳槽：北京市六一儀器廠(型號：DYCP-31P)。

1.3 動物分組及給藥 SPF級SD雄性大鼠，體重(225.0±10)g，由上海中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗動物中心提供〔使用證號：SYXK(滬)：2004-0005〕。大鼠隨機分為4組：①正常對照組、②孤養(yǎng)加慢性不可預見性溫和刺激模型組(模型組)、③模型+文拉法辛組(西藥組)、④模型+甘麥大棗湯加味組(中藥組)。其中西藥組大鼠按體重比為正常人的10倍劑量灌胃給藥，中藥組大鼠按體重比為正常人的20倍劑量灌胃給藥，正常對照組與模型組用等量生理鹽水灌胃，每日一次。

1.4 大鼠造模 參照文獻〔1〕，將②、③、④組大鼠孤養(yǎng)，接受各種不同的應激刺激，包括冰水游泳(4℃，5 min)、熱應激(42℃，5 min)、潮濕環(huán)境(12 h)、搖晃(1 次/s，15 min)、夾尾(1 min)、配對飼養(yǎng)(12 h)、禁水(24 h)、禁食(48 h)和晝夜顛倒等刺激，每日一種，每種刺激平均接受2次。

1.5 海馬總RNA的提取 造模第21天殺鼠，分離海馬。每100 mg組織加入1 ml Trizol，高速組織搗碎器充分打碎組織塊制備勻漿，按試劑盒說明書提取總 RNA。紫外分光光度計測定A260和A280，甲醛變性凝膠電泳鑒定RNA質量。

1.6 RT-PCR法測定海馬GR、BDNF mRNA含量 每組取4個質量合格的RNA樣本，等量混合后取2.0 μg總RNA進行RT反應。GR：取4 μl RT反應產物，以 β-actin為內參，進行PCR擴增反應，擴增條件：94℃ 5 min，(94℃ 45 s，60℃ 60 s，72℃ 45 s)×30 個循環(huán)，72℃ 5 min，4℃ 終止;BDNF：取 2 μl RT 反應產物，以GAPDH為內參，進行 PCR擴增反應，擴增條件：94℃ 5 min，(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s)×30 個循環(huán)，72℃ 5 min，4℃終止。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖片進行密度積分的比較。

1.7 放免法測定血漿CORT、ACTH含量 腹主動脈取血5 ml，加入含 50 μl肝素(12 500單位)的試管中，混勻，4℃，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，取上清分裝2～3份，－20℃保存。測定前，使樣本置于室溫或冷水中復融，再次4℃，3 000 r/min離心5 min，取上清，按照試劑盒說明書操作，測定血漿CORT、ACTH含量。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)以s表示。

2 結果

2.1 垂體重/體重及腎上腺重/體重結果 由表1可見，與正常組比較，模型組大鼠垂體重/體重顯著增高，腎上腺重/體重降低，但無統(tǒng)計學差異;與模型組比較，西藥組和中藥組大鼠的垂體重/體重有下降趨勢，腎上腺重/體重有上升的趨勢，但均無統(tǒng)計學差異。

表1 各組大鼠垂體重/體重及腎上腺重/體重的比較(s)

表1 各組大鼠垂體重/體重及腎上腺重/體重的比較(s)

與正常組比較：1)P＜0.05;下表同

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2.2 血漿ACTH、CORT含量檢測 由表2可見，與正常組比較，模型組大鼠的血漿CORT、ACTH含量顯著增高;與模型組比較，西藥組與中藥組大鼠的血漿CORT含量顯著下降，血漿ACTH含量有下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異。

表2 各組大鼠血漿CORT、ACTH含量比較(s)

表2 各組大鼠血漿CORT、ACTH含量比較(s)

與正常組比較：1)P＜0.05;與模型組比較：2)P＜0.05

組別 n 血漿ACTH含量(pg/ml)血漿CORT含量(ng/ml)正常組9.3±1.53 222.3±45.75模型組 8 14.5±5.751) 315.9±49.031)西藥組 8 11.8±3.86 239.3±57.682)中藥組 8 12.9±3.66 227.8±44.442)8

2.3 海馬GR、BDNF mRNA表達變化 由圖1、表3可見，與正常組比較，模型組大鼠海馬GR、BDNF mRNA表達降低;與模型組比較，西藥組及中藥組大鼠海馬GR、BDNF mRNA的表達呈現(xiàn)不同程度的上調。

表3 各組大鼠海馬GR/β-actin和BDNF/GAPDH密度積分比值比較

圖1 大鼠海馬GR、BDNF mRNA RT-PCR擴增產物凝膠電泳圖

3 討論

孤養(yǎng)加慢性不可預見性溫和刺激所致抑郁癥模型是目前廣泛采用的抑郁癥模型〔2〕。該模型與中醫(yī)認為七情所傷導致郁證的理論也較為符合，我們以往的研究結果也顯示該抑郁癥模型大鼠水平運動、垂直活動及糖水消耗顯著下降，表明該模型大鼠在行為學上表現(xiàn)為活動度、對新鮮周圍環(huán)境的好奇度以及對獎賞反應均顯著下降，而中藥甘麥大棗湯加味與西藥文拉法辛對行為學異常有較好糾正作用〔3〕。

HPA軸在機體的應激反應中發(fā)揮著重要作用。當機體受到刺激時，下丘腦室旁核(PVN)小細胞神經元分泌包括CRH在內的多種促進ACTH分泌的激素，進而刺激垂體分泌ACTH，ACTH經血循環(huán)達腎上腺，促使GC分泌增多〔4〕。本實驗中，與正常組比較，模型組大鼠的垂體重/體重以及血漿ACTH、CORT濃度顯著高于正常組，提示模型組大鼠HPA軸功能亢進。

作為邊緣系統(tǒng)的重要構件，海馬對情緒反應起抑制作用。GR在海馬上表達最高，而海馬正是通過GR抑制應激過程中亢進的HPA軸，使之恢復到基礎水平。長期慢性應激刺激能夠持續(xù)激活HPA軸，導致GC水平升高，過量GC極易造成富含GR的海馬受損，從而減弱海馬對HPA軸的抑制作用，進一步加重HPA軸的亢進〔5〕。動物實驗發(fā)現(xiàn)抑郁癥動物模型腦內的GR基因表達水平明顯低于對照組〔6〕。GR mRNA表達下調、功能失敏，不能正常的負反饋抑制，從而使HPA軸的亢進得到長期維持。本實驗結果顯示，模型組大鼠海馬GR mRNA的表達降低，與文獻報道一致。腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)與神經元的可塑性和存活有關，BDNF表達水平下降可能參與慢性應激抑郁癥時海馬結構和功能的改變〔7〕。本實驗結果顯示，模型組大鼠海馬BDNF mRNA的表達降低，提示模型大鼠海馬功能異常。

本實驗采用選擇性5-HT及NE再攝取抑制劑文拉法辛為西藥對照，本研究結果顯示西藥組大鼠海馬BDNF mRNA的表達較模型組上升，提示中樞系統(tǒng)5-HT及NE增高減少了海馬損傷，而海馬功能的維護抑制了HPA軸過度亢進，表現(xiàn)為西藥組大鼠血漿CORT濃度較模型組大鼠顯著下降，垂體重/體重及血漿ACTH濃度亦呈下降趨勢。

多年臨床應用表明甘麥大棗湯為基礎配伍加味藥治療抑郁癥療效顯著〔8〕。本研究結果顯示中藥組大鼠海馬GR及BDNF mRNA表達較模型組升高，提示中藥對海馬有保護作用，從而抑制了HPA軸過度亢進，表現(xiàn)為中藥組大鼠血漿CORT濃度較模型組大鼠顯著下降，血漿ACTH濃度亦呈下降趨勢。

1 Willner P，Towell A，Sampson D，et al.Reduction of sucrose preference by chronic mild unpredictable stress and its restoration by a tricyclic antidepressant〔J〕.Psychopharmacology，1987;93(3)：358-64.

2 Gronli J，Murison，F(xiàn)iske E，et al.Effects of chronic mild stress on sexual behavior，locomotor activity and consumption of sucrose and saccharine solutions〔J〕.Physiol Behav，2005;84(4)：571-7.

3 張學禮，金國琴，戴薇薇，等.甘麥大棗湯加味對抑郁癥大鼠海馬cAMP-蛋白激酶A途徑的影響〔J〕.上海中醫(yī)藥大學學報，2006;20(4)：73-5.

4 楊 權.下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸應激反應的中樞控制〔J〕.生理科學進展，2000;31(3)：222-6.

5 Hauger RL，Helat SG.Edei EE1 increased corticotrophin releasing factor receptor expression and adrenocorticotropic hormone responsiveness in anterior pituitary cells of Wistar-Kyotorats〔J〕.J Neuroendocrinol，2002;14(2)：126-34.

6 Meyer U，van Kampen M，Isovich E，et al.Chronic psychosocial stress regulates the expression of both GR and MR mRNA in the hippocampal formation of tree shrews〔J〕.Hippocampus，2001;11(3)：329-36.

7 Santarell IL，Saxe M，Gross C，et al.Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants〔J〕.Science，2003;301(5634)：805-9.

8 袁燦興.情志疾病心肝求甘麥大棗奇功收：胡建華運用加味甘麥大棗湯治療神經精神疾病〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志，1996;7(1)：4-6.