正交試驗法優選軟肝顆粒水提工藝*

陳劍平 ，胡兆流 ，黃詩瑩 ，王佛長 ，鄭 平 ，陳秋谷 ，鄭 琳 ，易鐵鋼 ，張尚斌 ，邢宇鋒 ，韓志毅 ，童光東 ，周大橋 △

（1.廣東省深圳市中醫院·深圳市醫院中藥制劑研究重點實驗室，廣東 深圳 518033； 2.廣東省深圳市中醫院肝病科肝病研究室，廣東 深圳 518033）

軟肝顆粒是醫院治療慢性肝病的經驗方，由醋鱉甲、醋龜甲、麩炒枳殼、丹參、半邊蓮、黃芪等13味中藥組方，具有活血化瘀、軟肝散結、益氣健脾養陰功效，用于氣血瘀滯、氣陰兩虛所致脅痛、腹脹、口干口苦，尤其適用于肝纖維化、肝硬化的治療[1－7]。本研究中按醫療機構應用傳統工藝配制中藥制劑備案的要求，擬將該方進一步研制成顆粒劑。為了全面提取有效活性成分，更好地發揮療效，根據處方中所含飲片的不同特性，首先對醋鱉甲、醋龜甲飲片的先煎工藝進行考察[8－9]，確定先煎條件，再根據處方中其余各飲片的化學成分和藥理等性質[10－13]進行合煎水提工藝考察，以水提液中柚皮苷含量和干膏量為評價指標，采用正交試驗對其提取工藝進行優化，為工業化生產提供參考依據?，F報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：LC－20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司，SIL－20A型自動進樣器）；CQ－250－DST型超聲波清洗儀（功率為250 W，頻率為40 kHz，深圳和科達精密清洗設備股份有限公司）；AUMA220D型分析天平（日本島津公司）；500－2型恒溫干燥箱（上海躍進醫療器械廠）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公司）；LD5－2A型低速離心機（北京京立有限公司）。

試藥：柚皮苷對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號為WK916051305，純度不低于98%）；試驗所用飲片均購自深圳市康美藥業有限公司，經深圳市中醫院藥檢室劉紀青主任鑒定，均符合2015年版《中國藥典（一部）》各飲片項下的要求；水為純化水，甲醇、乙腈（默克公司）為色譜純。

2 方法與結果

2.1 飲片先煎工藝考察

粒度：取醋鱉甲、醋龜甲適量，粉碎成最粗粉、粗粉和中粉，備用；稱取醋鱉甲、醋龜甲飲片、最粗粉、粗粉和中粉各50 g（醋鱉甲、醋龜甲各25 g），分別加入10倍量水，煎煮1 h，放冷，水提液離心，濾過，定容至 500 mL，量取50 mL水提液，置干燥至恒重的蒸發皿，干燥，稱定質量，計算干膏得率。結果飲片、最粗粉、粗粉、中粉的干膏得率分別為 7.66% ，10.18% ，10.33% ，10.23% ，表明飲片的干膏得率較粉碎低，最粗粉、粗粉、中粉的干膏得率差異不大，考慮到可操作性因素，最終采用最粗粉作為醋鱉甲、醋龜甲的先煎粒度。

時間：取醋鱉甲、醋龜甲的混合最粗粉3份，每份50 g（醋鱉甲、醋龜甲各25 g），加入10倍量水，分別煎煮0.5，1.0，1.5 h，放冷，水提液離心，濾過，定容至 500 mL，量取50 mL水提液，置干燥至恒重的蒸發皿，干燥，稱定質量，計算干膏得率。結果先煎 0.5，1.0，1.5 h 的干膏得率分別為 10.39% ，10.45% ，10.60% ，表明煎煮時間對醋鱉甲、醋龜甲的干膏得率影響不大，考慮到節約時間因素，最終選擇先煎0.5 h作為先煎時間。

加水倍數：取醋鱉甲、醋龜甲的混合最粗粉3份，每份 50 g（醋鱉甲、醋龜甲各 25 g），分別加 8，10，12 倍量水，先煎0.5 h，放冷，水提液離心，濾過，定容至500 mL，量取50 mL濾液，置干燥至恒重的蒸發皿，干燥，稱定質量，計算干膏得率。結果加8，10，12倍量水的干膏得率分別為 7.38% ，10.43% ，10.55% ，表明加水倍數對醋鱉甲、醋龜甲的干膏得率影響較大，考慮到節約用水因素，最終選擇加10倍量水。

2.2 飲片合煎工藝及干膏含量測定

根據2.1項下考察結果，醋鱉甲、醋龜甲采用最粗粉，先煎0.5 h，后加入其余各味飲片合煎，水提液趁熱濾過，放冷，濾液濃縮至200 mL。采用正交試驗法，以水提液中柚皮苷含量和干膏量為評價指標，對影響提取工藝的加水倍數（因素A）、提取時間（因素B）、提取次數（因素 C）進行優選，因素水平表見表 1。量取濃縮液50 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，按照干燥失重測定法（2015年版《中國藥典(四部)》通則0831）測定，計算干膏量。

表1 L9(34)因素水平表

2.3 柚皮苷含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：AgilentTC －C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈(A)－水(B)，梯度洗脫(0～12 min時19%A，12.01～35 min 時 19% → 25%A，35.01～40 min 時19%A)；流速：0.8 mL ／min；檢測波長：283 nm；進樣量：10 μL。

2.3.2 溶液制備

精密量取 2.2項下濃縮液 1 mL，加甲醇定容至20 mL，過 0.45 μm 微孔濾膜，取續濾液，即得供試品溶液。取柚皮苷對照品0.5 mg，精密稱定，加甲醇溶液并定容至1 mL，即得對照品溶液。稱取缺枳殼的處方量，按2.2項下方法提取濃縮，按供試品溶液制備方法制作陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學考察

專屬性考察：取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進行測定。結果供試品溶液在與對照品溶液相同保留時間處有相同色譜峰，而陰性對照無干擾，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

標準曲線制備與檢出限和定量限測定：精密吸取柚皮苷對照品貯備液適量，加甲醇逐級稀釋，分別制得質量濃度為 3.91 ～500.00 μg ／mL（3.91，7.81，15.62，31.25，62.50，125.00，250.00，500.00 μg ／mL）的系列對照品溶液，分別量取溶液10 μL，按擬訂色譜條件進樣，以柚皮苷峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度(X，μg／mL)為橫坐標進行回歸分析，得回歸方程 Y＝20 157.8 X－51 276.6，r＝0.999 9（n＝8）。結果表明，柚皮苷質量濃度在 3.91 ～ 500.00 μg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。同時，以峰面積為噪音 3倍（S／N＝3）和10倍（S／N＝10）的進樣質量濃度分別測得檢出限為0.25 μg ／mL，定量限為 0.74 μg ／mL。

精密度試驗：精密吸取2.3.2項下對照品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果的 RSD為0.15%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取2.3.2項下供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于 0，2，4，8，12，24 h 時進樣分析，記錄峰面積。結果的 RSD為 1.04%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取2.2項下提取的同一樣品6份，按2.3.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件分析，記錄峰面積。結果的 RSD為1.05%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知質量濃度的供試品溶液共9份，分別加入高、中、低3種不同含量的對照品，每組3份，按2.3.2項下方法制備待測溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 柚皮苷加樣回收試驗結果(n＝9)

2.4 正交試驗設計與結果

按 L9（34）正交表設計試驗，采用加權評分法分析結果，設定水提液的干膏量和柚皮苷的含量加權系數分別設為0.5，綜合評分值＝（干膏量／干膏量最大值＋柚皮苷含量／柚皮苷含量最大值）×0.5×100，結果見表 3和表4。由表3可見，提取條件以A3B3C3為佳。為了驗證直觀分析結果，對試驗數據進行了方差分析，結果表明，因素A和因素C均對水提工藝中干膏量和柚皮苷含量有顯著性差異。綜合各因素影響水平為煎煮次數C＞A＞B，從溶劑及節省時間考慮，確定最佳提取工藝為 A3B1C3，即加 10 倍量水，煮 3 次，每次煮 1.0 h。

表3 正交試驗設計及結果(n＝9)

表4 方差分析結果

2.5 最佳工藝驗證試驗

為驗證所得組合工藝的可行性，進行了3批驗證試驗。取處方量，按優選工藝進行提取，測定干膏量及柚皮苷含量，結果見表5。可見，驗證試驗綜合評分值的平均值為 96.15，RSD 為 0.59%(n＝3)，表明正交試驗優選的條件穩定可行，可作為軟肝顆粒的提取工藝。

表5 最佳工藝驗證結果

3 討論

3.1 提取工確定

軟肝顆粒方中醋鱉甲具有滋陰潛陽、軟堅散結的功效，主要用于肝纖維化的治療；醋龜甲可滋陰養血、益腎健骨，主要用于增強免疫力和促進康復。醋鱉甲、醋龜甲富含人體必需氨基酸、寡肽、微量元素等不易溶于水的物質，屬先煎類藥物中甲角類[14－16]，二者活性成分的提取率對肝纖維化的治療及恢復具有重大影響。為充分提取醋鱉甲、醋龜甲中有效成分，根據中藥傳統的提取方法，首先采用單因素試驗對醋鱉甲、醋龜甲的先煎粒度及先煎時間進行考察，再采用正交試驗進行醋鱉甲、醋龜甲藥液及其藥渣與其余各飲片合煎工藝的考察。對于提取液的純化，本試驗中采用水提濃縮，而非水提醇沉，目的是保持與湯劑一致的化學組成，保證藥效；同時，符合《中華人民共和國中醫藥法》中關于傳統工藝配制中藥制劑備案工作的要求，以便進一步研制成院內中藥制劑。

3.2 評價指標選擇

本研究中首選方中丹參中有效成分丹酚酸B作為提取工藝的篩選指標，結果在相同保留時間內存在干擾，分離度低；通過改變流速、調整流動相比例及更換不同流動相進行洗脫，均無顯著效果；經研究發現，干擾成分來自半邊蓮所含有的酚酸類[17]，通過半邊蓮陰性試驗發現相同保留時間內無干擾，可以確定干擾成分來自半邊蓮，但無法確認半邊蓮的干擾成分，故排除丹酚酸B作為指標成分。曾對黃芪中的黃芪甲苷進行測定，發現供試品溶液中黃芪甲苷保留時間內同樣存在干擾、分離度低的問題，故亦未選取黃芪甲苷作為評價指標。

3.3 不足

經試驗發現，枳殼中柚皮苷分離度好，紫外吸收強，出峰無干擾，保留時間相對適中，故最終選取柚皮苷含量作為水提工藝的評價指標[18]。本試驗中未能選擇處方中君藥的有效成分作為評價指標，是本研究存在的不足之處，將在后續研究中進行改進。本方法操作簡便，優選出的提取工藝穩定性好、可靠性強，可為進一步將軟肝顆粒開發成中藥制劑提供重要的試驗基礎。