重組C因子法檢測細菌內毒素的方法適用性研究*

裴宇盛 ，蔡 彤 △，陳 晨 ，高 華 ，魏 霞 ，劉 洋 ，王婷婷 ，祝清芬 ，陸益紅 ，樸晉華 ，劉 琦 ，張 蕻 ，李松梅

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629； 2.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101； 3.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇 南京 210019； 4.山西省食品藥品檢驗所，山西 太原 030001）

重組C因子法是細菌內毒素檢查法的補充替代方法，原理是將鱟試劑中的C因子采用生物技術重組獲得，用來替代海洋生物鱟作為鱟試劑原料唯一來源。該方法的推廣使用，可保護生態環境、減緩鱟資源枯竭速度[1]。由于鱟資源僅分布于中國及東南亞一帶和美國西海岸，我國鱟資源近年逐漸衰減[2]，以廈門為例，20世紀90年代與20世紀50年代相比，鱟資源減少了80% ～90%，現在主要棲息于人工建立的保護區[3]。歐洲大陸的動物保護主義理念的深入推廣，如3R理論（對使用實驗動物的實驗應減少、優化、替代），歐洲官方對重組C因子法認可先于世界其他各國，根據歐洲藥典會第160次會議決定，啟動將重組C因子法單獨作為正文方法（目錄號為2.6.32）的工作程序。美國食品藥物管理局(FDA)在2012年發布的指導原則中，將重組C因子法列為細菌內毒素檢查的補充替代方法。我國目前對重組C因子法的法定地位尚未明確，制備研究逐漸增多[4－7]，但有關重組 C 因子應用的研究較少[8－9]。

本研究中重點考察重組C因子法的品種適用性，選取了有代表性的6個典型品種，每個品種3個批次，進行重組C因子法干擾試驗，并經過國內3個實驗室進行復核驗證。以回收率為評價指標，以2015年版《中國藥典》為評價標準，并將4個實驗室應用該方法過程中產生的問題和解決方法進行總結，給擬采用該方法的實驗室提供相關經驗，以加快該方法在我國的應用推廣。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SynergyHT型多功能酶標儀（加拿大Biotek生物技術公司）；1389 A2型生物安全柜（美國Thermo有限公司）。

1.2 試藥

重組C因子試劑盒（Lonza，貨號為50－658U，批號為 0000591563；Hyglos GmbH，貨號為 609033，批號為17620）。干擾試驗樣品，注射用重組人干擾素 α－1b（深圳科興生物工程有限公司，批號為 201504022，201503008；北京三元基因工程有限公司，批號為20141005；品種1）；注射用磺芐西林鈉（?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰荆枮?0140902；湖南爾康湘藥制藥有限公司，批號為140709－4；瑞陽制藥有限公司，批號為15022602；品種2）；消癌平注射液（南京圣和藥業有限公司，批號分別為 201510151，201510211，201603171，品種3）；凍干人用狂犬病疫苗（vero細胞，遼寧成大生物制品有限公司，批號分別為 201407210，201407212，201407206，品種4）；甘精胰島素注射液（山東新時代藥業有限公司，批號為201509c003；遼寧博鰲生物制藥有限公司，批號為20150310；珠海聯邦制藥股份有限公司，批號為 20155082Z8A005B；品種 5）；赫賽?。ㄉ虾Ａ_氏制藥有限公司，批號分別為 N3742，N3749，N3753，品種 6）。

2 方法與結果

2.1 試驗設計

儀器靈敏度調節：靈敏度調節試驗為預試驗，將儀器的靈敏度調整到適合范圍，充分發揮試劑的檢測能力。標準曲線可靠性驗證試驗是各個國家藥典中規定的方法轉移試驗，用以證明該實驗室可以操作重組C因子法。干擾試驗是細菌內毒素檢查法的方法學驗證試驗，用以驗證樣品能否用于重組C因子法檢測。

品種選擇依據：為了驗證重組C因子法的品種適用性，選取了有代表性的6個典型品種，包括抗生素、生化藥品、重組技術產品、中藥注射液、病毒疫苗和單克隆抗體。中國食品藥品檢定研究院為實驗室1，山東省食品藥品檢驗研究院為實驗室2，江蘇省食品藥品監督檢驗研究院為實驗室3，山西省食品藥品檢驗所為實驗室 4。

2.2 儀器靈敏度調節

使用內毒素標準品和檢查用水，配制濃度為0.5 EU／mL的標準內毒素溶液，每步稀釋混勻時間不少于1 min。設置儀器參數：激發、發射波長為380 nm和440 nm；溫度為37℃；2次讀數之間間隔1 h；光學位置為底部；靈敏度（增益值）分別設為 35，40，45，50，55，60，65，70，75，80。加樣：0.5 EU ／mL 平行 4 孔，每孔 100 μL，加入酶標板，在37℃孵育10 min。配制檢測試劑：按順序將熒光底物、重組C因子緩沖液、重組C因子酶，按5 ∶4 ∶1（Hyglos的試劑按 1 ∶8 ∶1）比例充分、輕柔混合。混合后的檢測試劑須立即使用，不能保存。加樣：將每孔中加入0.1 mL配制好的檢測試劑，震板10 s。按上述儀器參數設置分別于時間零點和1 h點讀數。時間零點檢測結果記為 RFU（0），在 37℃孵育 1 h后，再次檢測結果記為 RFU（1 h）。按公式 logδRFU ＝log[RFU（1 h）－log RFU（0）]計算。結果判斷標準：選取 logδRFU 平均值最接近3.5的靈敏度作為試驗靈敏度。

儀器靈敏度調節試驗結果見表1。結果顯示，當增益值為 60 時，logδRFU（Lonza）為 3.61，最接近 3.5，因此使用Lonza試劑時將儀器靈敏度（增益值）設定為60。當增益值為 65 時，logδRFU（Hyglos）為 3.48，最接近3.5，因此使用Hyglos試劑時將儀器靈敏度（增益值）設定為65。

表1 儀器靈敏度（增益值）調整試驗結果

2.3 標準曲線可靠性驗證

使用內毒素標準品和檢查用水，配制濃度為5，0.5，0.05，0.005 EU ／mL 的標準內毒素溶液，每步稀釋混勻時間不少于1 min。另準備細菌內毒素檢查用水0.2 mL作為陰性對照。儀器參數設置同上。靈敏度根據2.2項下操作確定。配制檢測試劑步驟同2.2項下操作。每個濃度的細菌內毒素平行做3孔，陰性對照平行做 2孔。加樣步驟同2.2項下操作，完成后按公式logδRFU ＝log[RFU（1 h）－log RFU（0）]計 算 每 孔 的logδRFU，以logδRFU對內毒素濃度的對數值進行線性擬合，按《中國藥典》要求，｜r｜＞ 0.980 即判定為標準曲線可靠性驗證試驗符合規定。結果顯示，4個實驗室標準曲線可靠性驗證試驗均符合《中國藥典》規定，陰性對照值均低于標準曲線最低點(r＝0.999)，表明4個實驗室均能重復重組C因子法，符合方法確認規定。

2.4 干擾試驗

每個實驗室均按2.3項下方法制備標準曲線。具體品種名稱、稀釋處理方法、限度等見表2。供試品陽性對照（回收試驗）中，添加的標準內毒素濃度為0.5 EU／mL。每個品種3批，采用2個廠家的重組C因子試劑，每個試驗平行2管，進行干擾試驗研究，線性范圍為（0.005～5 EU ／mL）。

表2 6個品種的試驗信息

干擾試驗（回收率）結果見表3，結果顯示，2個廠家生產的重組C因子試劑，每個品種3批，6個典型品種共計18批次，4個國內實驗室的所有回收率均在50% ～200%范圍內，符合《中國藥典》規定。表明以上6個品種按表2中的處理方法均可使用重組C因子法進行檢測，且重復性較好，表明該6個品種在我國能使用重組C因子法進行日常質量控制。干擾試驗（內毒素檢測值）結果見表4。4個實驗室檢測結果一致。

表3 18批次樣品干擾試驗結果（%）

2.5 常見問題與解決策略

4個實驗室應用重組C因子法過程中產生的問題和解決策略見表5。常見問題劃分為7類21條目，可供擬開展重組C因子法檢測內毒素的實驗室參考。

3 討論

3.1 重組C因子法與細菌內毒素檢查法的關系

細菌內毒素檢查法根據《中國藥典》可分為凝膠法和光度測定法。光度測定法又分為動態濁度法、終點濁度法、動態顯色法、終點顯色法共4種。重組C因子法如收錄在《中國藥典》中，按此種分類模式應稱為終點熒光法，應算作光度測定法中的1種。其操作模式與其他4種光度測定法也很接近，只是由于熒光法的特點，需要預先試驗確定儀器的增益值（靈敏度）。作為鱟試劑的重組替代品，從生產工藝來說，應比自然提取的鱟試劑生物變異更小，有利于方法的標準化。

表4 18批次樣品內毒素檢測值

3.2 細菌內毒素檢查法與重組C因子檢查法的誤差

內毒素檢查法的誤差問題是重要特點。內毒素檢查法被各個國家藥典及國際藥典所收載。各個國家藥典中內毒素檢查法內容趨于一致。而其針對靈敏度復核、凝膠法干擾試驗、光度法干擾試驗回收率對于結果的誤差均規定為50% ～200%即符合規定[10]。因此重組C因子法作為內毒素檢查法的補充替代方法，其結果誤差的允許范圍也遵從此規定，本研究中的干擾試驗結果也是參考本標準。隨著內毒素檢查法和重組C因子法的廣泛應用與推廣，當產品內毒素含量處于質量標準邊緣時，更易出現超標結果[11]。因此，藥品生產企業在進行質量控制時，要盡量降低產品中的內毒素水平，以免造成檢測結果爭議[12－13]。

3.3 各種方法的干擾試驗

由于細菌內毒素檢查法中收載的6種方法，根據歐洲藥典收載細菌內毒素檢查法應用指導原則，顯色法由于與凝膠法和濁度法反應機理不同[14－15]，因此不能將凝膠法和濁度法的干擾試驗結論直接外推至顯色法。由此推斷重組C因子法因采用了熒光反應，同樣不能將干擾試驗的結論外推到其他方法，必須進行干擾試驗驗證[16]。本研究中選擇的6個典型品種具有一定代表性，可見重組C因子法在品種應用方面具有一定通用性。本研究中也為《中國藥典》收載重組C因子法提供了品種應用方面的數據支持。

表5 重組C因子法應用常見問題與解決策略匯總