重金屬銅化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫快速檢測方法的建立①

楊 浩 程龍球 黃建芳 朱柳蓉 劉 洋 向軍儉

(暨南大學(xué)抗體工程研究中心，生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)系，廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室，廣州 510632)

重金屬廣泛分布于自然界，隨著城市的急速擴張和工業(yè)的快速發(fā)展，大量重金屬因人為活動以非常態(tài)速度進入我們的生活環(huán)境，這些重金屬及其化合物多有致畸、致癌作用，并且都是蓄積性毒物，通過飲用水、藥材或食物鏈富集等方式進入機體，嚴重危害人類及動物的健康[1]。

環(huán)境污染最嚴重的重金屬包括：鉛、鎘、汞、鉻、砷，此外，還有毒性相對較弱的鎳、鋅、銅、鈷、錫等。雖然重金屬銅的毒性相對較弱，但是因其在工業(yè)、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)的廣泛應(yīng)用，銅污染的危害也越來越多地引起人們的關(guān)注[2,3]。2010年7月3日，福建紫金礦業(yè)紫金山銅礦濕法廠發(fā)生銅酸水滲漏事故，導(dǎo)致汀江部分河段水質(zhì)受到嚴重污染，并造成大量魚類死亡[4]。銅污染問題不僅在內(nèi)陸地區(qū)突出，近年來近海與河口環(huán)境銅污染也日趨嚴重，“藍牡蠣”和“綠牡蠣”的出現(xiàn)便是近海河口生物遭受銅污染影響的典型例證[5]。人體攝入過量的銅會引發(fā)一系列病變，急性銅中毒可引起惡心干嘔、腹痛腹瀉等胃腸道黏膜刺激癥狀，還可造成溶血性貧血、腎功能衰竭、甚至休克昏迷；慢性吸入銅粉塵或攝入銅含量過高，可導(dǎo)致胸悶氣憋，進而發(fā)展為塵肺，還會對肝和膽造成嚴重負擔(dān)，導(dǎo)致新陳代謝紊亂，甚至出現(xiàn)肝硬化、肝腹水等嚴重疾病[1-6]。另外，銅鹽具有一定殺菌效果，在飼料中被廣泛使用，但高劑量的銅進入家畜的體內(nèi)很難被代謝，隨著生物累積效應(yīng)造成家畜中毒死亡，還會因食用家畜肉制品而直接威脅人類健康[7,8]。因此，加強食品和環(huán)境衛(wèi)生的重金屬銅的監(jiān)查檢測迫在眉睫。

常規(guī)重金屬檢測方法多采用物理/化學(xué)方法，如原子吸收光譜法(AAS)、原子熒光光譜法(AFS)、電感耦合等離子體光譜分析法(ICP)等，雖然其檢測結(jié)果準確，可信度高，但需要大型儀器設(shè)備和專業(yè)人員操作，分析時間長，成本昂貴，有一定時間地點局限性，難以適應(yīng)突發(fā)性的環(huán)境污染事件或大規(guī)模環(huán)境質(zhì)量篩查檢測[9-11]。而近年來發(fā)展迅速的免疫學(xué)快速檢測方法因其方便、快捷、靈敏度高、特異性強、費用較低，能滿足大批量現(xiàn)場快速檢測等特性[12-14]，越來越多地受到國內(nèi)外科研工作者的重視和研究。

化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法(Chemiluminescence link-ed enzyme immunoassay，CLEIA)是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法相互結(jié)合的產(chǎn)物，其基本原理是化學(xué)發(fā)光的強度(相對光單位，RLU)和反應(yīng)物或產(chǎn)物的濃度呈相關(guān)性，同時具有化學(xué)發(fā)光的高靈敏度和免疫分析的高特異性，其檢測線性范圍和靈敏度均優(yōu)于放射免疫分析，方法簡單，且無放射性污染，適用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測[15]。本研究旨在建立檢測銅離子的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫快速檢測方法策略，為監(jiān)測中草藥、食品和環(huán)境中重金屬銅的污染提供高效、便捷、準確、價廉的新檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 CuSO4·5H2O(天津大茂化學(xué)試劑廠)，Pb(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)、Ca(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)標準液(國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院)，GBW07602(GSV-1)灌木枝葉、GBW07404(GSS-4)土壤標準物質(zhì)(國家標準物質(zhì)網(wǎng))，HNO3[AR](廣州化學(xué)試劑廠)，p-SCN-Bn-NOTA(2-S-(4-Isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid)雙功能螯合劑、單NOTA(Macrocyclics)，雞卵清蛋白OVA(Sigma)，銅離子完全抗原Cu-NOTA-OVA、銅離子單克隆抗體細胞株4F12及純化抗體[16](暨南大學(xué)抗體工程中心)，羊抗鼠IgG-HRP(廣州國奧生物技術(shù)有限公司)，HRP化學(xué)發(fā)光底物(北京科躍中楷生物技術(shù)有限公司)，96孔黑色酶標板(Greiner Bio-one)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，30 kD超濾管、超純水(Millipore)，植物中草藥樣品(13份)由廣州地理研究所饋贈，土壤樣品(18份)由暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院饋贈。

1.1.2主要儀器 Synergy H1多功能微孔板檢測酶標儀(BioTek)，數(shù)字pH計(Mettler-Toledo)，磁力攪拌器(IKA)，分析電子天平(Sartorius)，MARS6微波消解儀(PyNN·CEM)，GS-1趕酸儀(南京瑞尼克科技開發(fā)有限公司)，AKTA蛋白純化儀、CoolSafe真空冷凍干燥機(Gene)，CO2細胞培養(yǎng)箱、X-Series 2電感耦合等離子體發(fā)射光譜質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific)，PinAAcle AA900T火焰石墨爐一體原子吸收光譜儀(PerkinElmer)。

1.2方法

1.2.1間接競爭CLEIA法的建立 將檢測完全抗原稀釋至最佳工作濃度(100 ng/ml)后，100 μl每孔包被黑色酶標板，4℃過夜；PBST緩沖液洗滌后(后文簡稱“洗滌后”)，200 μl每孔5%(w/v)脫脂奶粉封閉液37℃封閉40 min；洗滌后，每孔加入50 μl系列梯度濃度(0～400 ng/ml)競爭物標準品Cu-NOTA和50 μl稀釋至最佳工作濃度(48 ng/ml)的單抗，以PBS緩沖液作空白對照，混勻后37℃孵育1 h；洗滌后，每孔加入100 μl稀釋至工作濃度(1∶8 000)的HRP酶標羊抗鼠二抗，37℃孵育40 min；洗滌后，每孔加入平衡至室溫(10 min)的HRP魯米諾化學(xué)發(fā)光底物A、B液各50 μl，室溫避光反應(yīng)10 min，上機讀取發(fā)光信號(過程原理如圖1所示)。每一檢測采用3個平行組均值，計算標準曲線與線性參數(shù)。

1.2.2間接競爭CLEIA法的性能評價 在方法線性范圍內(nèi)，配制低、中、高(10、40、70 ng/ml)3種濃度標準液，平行重復(fù)5次，測定并計算實際檢測濃度，評價其準確度與精密度；制備Pb2+、Mn2+等金屬離子半抗原母液，ICP-AES測定其濃度后配制相應(yīng)梯度濃度半抗原工作液，用以替代銅半抗原標準液，按間接競爭CLEIA法檢測并計算各金屬IC50值，再通過公式Cross reactivity(%)=[IC50(銅離子)/IC50(其他金屬離子)]×100%，測定重金屬銅單抗與Pb2+、Mn2+等金屬離子半抗原及單NOTA的交叉反應(yīng)，平行重復(fù)3次，計算交叉反應(yīng)率并評價其特異性；將包被封閉后的酶標板在-20℃避光保存2、4、6、8周后，分別拿出測定低、中、高(10、40、70 ng/ml)3種濃度標準液，平行重復(fù)3次，測定并計算檢測濃度，通過SPSS軟件進行相關(guān)性統(tǒng)計學(xué)分析，評價其穩(wěn)定性。

分別在自來水、校園明湖水、灌木枝葉(GSV-1)消解液、土壤(GSS-4)消解液中添加低、中、高(10、40、70 ng/ml)3種濃度標準液，平行重復(fù)3次，測定并計算回收濃度，評價本方法分析過程中系統(tǒng)誤差的影響。

1.2.3對植物中草藥和土壤樣品檢測效果的評價

1.2.3.1植物中草藥和土壤樣品的檢測前處理 采用微波消解聯(lián)合沉淀法對樣品進行前處理：將固體類植物中草藥(13份)和土壤(18份)樣品先干燥至恒重，再用粉碎機和研缽分別粉碎樣品至均一小顆粒粉末狀。準確稱量0.200 0 g樣品，加入8 ml HNO3(土壤樣品加入反王水8 ml，即6 ml HNO3與2 ml HCl)，通風(fēng)櫥過夜或趕酸儀130℃預(yù)熱30 min預(yù)消解；選擇合適消解程序消解樣品(130℃爬升10 min，保持3 min；160℃爬升3 min，保持5 min；180℃爬升3 min，保持40 min；冷卻)；趕酸儀180℃趕酸后定容至合適量程(植物中草藥和土壤樣品分別定容至10 ml和25 ml)；消解液經(jīng)濾紙過濾后再經(jīng)0.22 μm 濾器過膜除雜；取5 ml定容液，通過1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至中性，并加入 200～400 μl 1%絮凝劑(聚丙烯酰胺，PAM)，靜置15 min后 2 000 r/min 離心5 min，去上清收集沉淀(可將銅與大多金屬離子有效分離)；再通過稀HNO3溶液緩慢復(fù)溶沉淀用于制備待測樣品[3,9,13,17-20]。

圖1 間接競爭化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法反應(yīng)原理Fig.1 Reaction principle of indirect competitive CLEIA

將標準物質(zhì)灌木枝葉(GSV-1)和土壤(GSS-4)以及空白對照HNO3與樣品一同消解，石墨爐原子吸收法(AAS)測定標準物質(zhì)實際銅含量，計算消解回收率，以評估消解過程是否合格。

1.2.3.2植物中草藥和土壤待測樣品的檢測 配制4 μg/μl單NOTA螯合劑，取前處理復(fù)溶后的植物中草藥和土壤樣品液5 ml，分別加入(5±1)μl和(40±8)μl單NOTA與樣品液中的銅離子偶聯(lián)15 min，制備具有反應(yīng)原性的銅離子半抗原待測樣品[10,13,21,22]；調(diào)節(jié)溶液pH至中性后通過間接競爭CLEIA法進行檢測(樣品的實際檢測以50 μl稀釋一定倍數(shù)的樣品液替代50 μl競爭物標準品Cu-NOTA，其余步驟與1.2.1間接競爭CLEIA法的建立相同)。以重金屬測定金標準ICP-AES儀器法(暨南大學(xué)分析測試中心)檢測結(jié)果為對照，采用SPSS軟件進行相關(guān)性統(tǒng)計學(xué)分析，以評價方法可靠性。

2 結(jié)果

2.1間接競爭CLEIA法的建立與性能評價

2.1.1標準曲線的建立 將0 ng/ml標準品孔的發(fā)光信號值定為B0，其他孔為B，以檢測抑制率(B0-B)/B0×100%為縱坐標，以Cu2+濃度log10對數(shù)為橫坐標，繪制標準抑制曲線。如圖2所示，標準曲線線性回歸方程為y=41.386x-1.865 5，R2=0.995，檢測靈敏度(IC50)為17.9 ng/ml，檢測限(IC10)為1.9 ng/ml，線性范圍為3.0～200 ng/ml。滿足GB5749《生活飲用水衛(wèi)生標準》、GB3838《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》、GB15618《土壤環(huán)境質(zhì)量標準》、《中國藥典》、《中醫(yī)藥-中藥材重金屬限量》等規(guī)定的銅最低限量值0.01 mg/L的檢測要求。

2.1.2準確度與精密度評價 在方法線性范圍內(nèi)，測定低、中、高3種濃度標準液，計算準確度回收率為98.8%～105.5%，精密度RSD≤5.0%(如圖3所示)，符合重金屬殘留分析檢測要求。

2.1.3特異性評價 各金屬離子及單NOTA交叉反應(yīng)率如圖4所示。除Mg2+、Zn2+分別與銅單抗有13.3%、3.3%的交叉反應(yīng)率外，其余金屬交叉反應(yīng)率均小于或近似于1%，其特異性總體良好，滿足檢測要求。

圖2 間接競爭CLIEA法標準曲線Fig.2 Standard curve of indirect competitive CLEIA

圖3 間接競爭CLEIA法準確度與精密度試驗Fig.3 Accuracy and precision test of indirect competitive CLEIA

2.1.4穩(wěn)定性評價 將包被封閉后的酶標板在-20℃避光保存2、4、6、8周后，分別拿出測定低、中、高3種濃度標準液，計算檢測濃度。以0周酶標板標準液測定值為基準，通過SPSS軟件分析各周不同標準液檢出值，如圖5所示，第8周低濃度(10 ng/ml)標準液實際檢測值與基準值出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，提示包被封閉后的酶標板在-20℃避光保存6周以內(nèi)使用為佳。

圖4 間接競爭CLEIA法特異性試驗Fig.4 Specific test of indirect competitive CLEIA

圖5 間接競爭CLEIA法穩(wěn)定性試驗Fig.5 Stability test of indirect competitive CLEIA

表1 間接競爭CLEIA法銅離子添加回收率Tab.1 Add recovery rate of copper ions by indirect competitive CLEIA

2.1.5添加回收試驗 各溶液添加回收試驗結(jié)果如表1所示。對比可知，低濃度添加回收率略高于高濃度，提示低濃度樣本在檢測體系中可能更易受到系統(tǒng)誤差的干擾影響。此外，溶液基質(zhì)成分相對簡單的自來水添加回收率也優(yōu)于相對復(fù)雜的校園明湖水以及灌木枝葉和土壤消解液，提示溶液基質(zhì)成分越簡單，實際檢測值的準確性越高，回收率更好，對檢測系統(tǒng)的干擾更小。

表2 標準物質(zhì)標準銅含量及測定結(jié)果Tab.2 Standard and detected copper content of stand-ard substances

2.2植物中草藥和土壤樣品微波消解回收率計算 標準物質(zhì)的標準銅含量及消解后實測銅含量結(jié)果詳見表2，灌木枝葉和土壤標準物消解回收率經(jīng)計算分別為88.8 %與107.4 %，消解合格。

2.3植物中草藥和土壤待測樣品的制備與檢測

2.3.1植物中草藥樣品中銅含量的測定 制備植物中草藥待測樣品(13份)后，由間接競爭CLEIA法與ICP-AES儀器法分別對同一樣品銅含量進行測定，結(jié)果詳見表3。采用SPSS軟件進行相關(guān)性統(tǒng)計分析，相關(guān)系數(shù)為0.972，兩種方法檢測結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)，表明間接競爭CLEIA法可應(yīng)用于一般植物樣品中銅含量的測定。

2.3.2土壤樣品中銅含量的測定 制備土壤待測樣品(18份)后，由間接競爭CLEIA法與ICP-AES儀器法分別對同一樣品銅含量進行測定，結(jié)果詳見表4。采用SPSS軟件進行相關(guān)性統(tǒng)計分析，相關(guān)系數(shù)為0.989，兩種方法檢測結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)，表明間接競爭CLEIA法可應(yīng)用于一般土壤樣品中銅含量的檢測。

表3 中草藥植物樣品重金屬銅含量測定結(jié)果Tab.3 Determination of copper content in herbal plants samples

表4 土壤樣品重金屬銅含量測定結(jié)果Tab.4 Determination of copper content in soil samples

3 討論

本研究使用p-SCN-Bn-NOTA雙功能螯合劑偶聯(lián)重金屬銅離子與載體蛋白以制備重金屬完全抗原并免疫小鼠獲得抗重金屬銅單克隆抗體，以此抗原、抗體為基礎(chǔ)建立化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法，并將其應(yīng)用于固體類植物中草藥和土壤樣品中銅含量的實際檢測，在已有文獻中少有相關(guān)方面的報道。

本方法靈敏度、檢測限等參數(shù)均符合國家法定相關(guān)樣品銅離子檢測技術(shù)指標的要求，且優(yōu)于傳統(tǒng)ELISA方法，為重金屬免疫學(xué)檢測新型試劑盒的研發(fā)提供了依據(jù)。相對于常規(guī)重金屬大型儀器檢測法，本研究方法具有方便、快捷、靈敏度高、特異性強、費用較低，能滿足大批量現(xiàn)場快速檢測等特性，且在中草藥植物和土壤樣品的實際檢測應(yīng)用中與ICP-AES儀器法相比具有良好的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)>0.95)。相對于郝代玲等[16]建立的銅間接競爭ELISA，檢測靈敏度為28.9 ng/ml以及Kong等[25]建立的銅間接競爭ELISA，檢測限為3 ng/ml，本研究所用的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫間接競爭法，檢測靈敏度為17.9 ng/ml，檢測限為1.9 ng/ml，均有提升。

重金屬在實際環(huán)境樣品中多以固體化合物形式存在而不能直接檢測，需要對其進行前處理使之釋放于液相環(huán)境中來，且樣品前處理的好壞直接關(guān)系到后續(xù)檢測的準確性。本研究通過微波消解聯(lián)合沉淀法對環(huán)境樣品進行前處理，并與單NOTA偶聯(lián)制備具有反應(yīng)原性的半抗原待測樣品。微波消解法作為一種新型樣品前處理方法，具有樣品處理簡單、消化程度完全、回收率高、對環(huán)境污染小、勞動強度相對較低等優(yōu)點，使其在重金屬樣品前處理中得到廣泛應(yīng)用[21,26]。沉淀法工藝簡單、操作方便、經(jīng)濟實用，且針對各金屬離子的沉淀平衡常數(shù)(pKsp)可通過調(diào)節(jié)不同的溶液pH值來實現(xiàn)不同金屬離子的沉淀、分離和回收[19,20]。免疫學(xué)檢測技術(shù)理論上適用于任何一種能產(chǎn)生抗體的被分析物，針對不同重金屬設(shè)計和制備其抗原、抗體，可使重金屬免疫學(xué)檢測技術(shù)進一步推廣。探索不同環(huán)境樣品的個性化前處理方式，降低復(fù)雜樣品的基質(zhì)干擾以及開發(fā)更為簡便快捷的重金屬免疫學(xué)快速檢測方法(如試紙條法)仍是關(guān)鍵問題。