類風濕關節炎患者破骨細胞分化情況及其與骨破壞的關系①

蔡 輝 徐子涵 商 瑋 郭郡浩 趙智明 沈俊逸

(東部戰區總醫院(原南京軍區南京總醫院)中西醫結合科，南京 210002)

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是最常見的炎性關節病，可導致進行性關節損傷和關節功能喪失，進而造成殘疾[1]。已有研究表明，骨質流失在RA疾病早期就開始了，RA合并骨質疏松癥的發生率較一般人群明顯增加[2]。破骨細胞(Osteoclast，OC)是人體內的主要骨吸收細胞，RA骨破壞主要是由于OC異?；罨瘜е碌腫3]。本研究通過分離RA患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，經核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator of nuclear factor-κB lig-and，RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)誘導培養為OC，觀察RA患者OC的分化情況，并分析該分化情況與RA骨破壞的關系，探究OC在RA骨破壞中的作用，以期為RA骨破壞的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1對象 選取2013年至2014年在東部戰區總醫院中西醫結合科就診的符合2010年RA分類標準[4]的活動期RA患者12例，其中男2例，女10例，年齡(42.3±14.4)歲。健康志愿者10例為對照組，男7例，女3例，年齡(42.2±18.5)歲。兩組入選者均無長期服用抗凝劑、性激素及影響骨代謝的藥物史，無糖尿病、甲狀腺、甲狀旁腺等內分泌系統疾病，無嚴重肝腎功能損害。兩組患者均簽署知情同意書，并經過東部戰區總醫院倫理委員會批準。

1.1.2試劑 RANKL、M-CSF(Pepro Tech公司，美國)、α-MEM培養基(Gibco公司，美國)、胎牛血清(FBS)(杭州四季青，中國)、人淋巴細胞分離液(Sigma公司，美國)、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒(南京建成，中國)、甲苯胺藍染液(上海碧云天，中國)。

1.2方法

1.2.1建立外周血OC培養體系 分別采集RA組和對照組外周血8 ml，采用Ficoll密度梯度離心法分離獲得PBMC，用α-MEM完全培養液配制成PBMC細胞懸液，調整細胞密度為2×106個/cm2接種于培養皿。培養箱(37℃、5%CO2)中孵育2 h，棄培養液，貼壁細胞為單核細胞，胰酶消化，調整細胞密度為2×105個/cm2接種于空白24孔板和已預置骨磨片的24孔培養板中，設3個復孔，用α-MEM完全培養液(含100 μg/L RANKL、50 μg/L M-CSF)培養，置于37℃、5%CO2培養箱中，2～3 d換液1次。

1.2.2TRAP染色并計數 培養14 d后對接種于空白24孔板中的細胞進行TRAP染色。按TRAP染液說明書(南京建成)配制30 ml底物孵育液，37℃水浴10 min；用固定液將細胞固定5 min，水洗，加入底物孵育液37℃避光孵育60 min，水洗，用甲基綠復染 2～3 min，水洗。光鏡下觀察，胞漿呈深紅色為陽性反應。將TRAP染色陽性且細胞核≥3個的多核巨細胞認定為OC。每孔隨機取10個視野計數OC個數，重復計數3次，取均值。

1.2.3骨吸收功能檢測 培養21 d后取出骨磨片，將其分為A、B兩組，2.5%戊二醛將A組骨磨片固定10 min，乙醇脫水，加入1%甲苯胺藍染色10 min，水洗，光鏡下觀察骨吸收陷窩；B組骨磨片經2.5 %戊二醛固定2 h，1%鋨酸固定2 h，乙醇逐級脫水，臨界點干燥，鍍金膜，掃描電鏡下觀察骨吸收陷窩。

1.2.4RA患者骨破壞的臨床評估 雙手X線Sharp評分：對RA患者進行雙手X線攝片，由專業的放射科人員閱片，參照改良的Sharp評分標準[5]，對手和腕18個區域進行關節間隙狹窄評分(0～4分)，對17個區域進行骨侵蝕評分(0～5分)，計算關節間隙狹窄評分與骨侵蝕評分之和。

1.2.5骨密度(Bone mineral density，BMD)檢測 采用美國GE公司的Lunar Prodigy骨密度儀通過雙能X線吸收法(Dual energy X-ray absorptiometry，DXA)對RA患者腰椎L1-L4、全髖部、股骨頸進行檢測，以T-score(T值)最低處表示BMD。

2 結果

2.1兩組OC生成數量的比較 經TRAP染色后，顯微鏡下觀察，兩組均可見TRAP陽性細胞的多核巨細胞，細胞體積大，呈類圓形，胞漿著色加深，細胞內可見3～5個以上細胞核(見圖1)。RA組生成的OC數量較對照組明顯增加，差異有統計學意義(P< 0.05)，見圖2，表1。

2.2兩組骨吸收陷窩實驗的比較 細胞與骨磨片共培養21 d，光鏡下可見A組骨磨片上出現深染的骨吸收陷窩，邊界清晰，呈類圓形或不規則形。與對照組對比可見，RA組形成的骨吸收陷窩數量較多，面積較大(見圖3)。掃描電鏡觀察B組骨磨片，可見陷窩底部具有因骨膠原纖維殘留而顯粗糙的骨吸收特征，陷窩邊緣呈貝殼狀或不規則形。RA組形成的骨吸收陷窩面積較大，陷窩較深，呈穿鑿樣；而對照組形成的骨吸收陷窩面積小而淺(見圖4)。

圖1 光鏡下TRAP染色的觀察Fig.1 Observation of TRAP staining under an optical microscopeNote: A.×100；B.×200；C.×400.

圖2 兩組TRAP染色比較(×200)Fig.2 Comparison of TRAP staining in two groups(×200)Note: A.RA Group；B.Control Group.

表1 兩組OC生成數量比較(個/10個視野)Tab.1 Comparison of OCs numbers in two groups (/10 bins)

圖3 光鏡下骨吸收陷窩的觀察(×200)Fig.3 Observation of bone resorption lacunae under an optical microscope(×200)

2.3相關分析 對RA組患者進行骨質破壞的臨床評估(Sharp評分和BMD檢測)，將RA組OC數量分別與Sharp評分和BMD(T值)進行相關分析。RA組OC數量與Sharp評分呈顯著正相關(r=0.810，P=0.001)，與BMD(T值)呈顯著負相關(r=-0.685，P=0.014)(見表2，圖5)。

圖4 掃描電鏡下骨吸收陷窩的觀察(×1 000)Fig.4 Observation of bone resorption lacunae under a scanning electron microscopy(×1 000)

表2 RA組OC數量與骨質破壞臨床指標的相關分析(n=12)Tab.2 Analysis of number of OCs and clinical indicators of bone destruction in RA group(n=12)

圖5 RA組OC數量與Sharp評分和BMD相關性分析散點圖Fig.5 A scatter diagram of correlation analysis between number of OCs and clinical indicators of bone destruction

3 討論

RA好發于40～50歲女性，在我國RA的臨床患病率為0.32%～0.38%[6]。RA會造成關節軟骨破壞和骨侵蝕，影響關節功能而降低患者生活質量。高疾病活動度、自身抗體陽性和早期關節損傷，往往是不良預后的特征性因素[7]。

OC是主要的骨吸收細胞，來源于單核/巨噬細胞系統。OC的異常增生與活化在RA骨破壞中發揮重要作用[8]。在膠原誘導性關節炎小鼠模型的研究中發現，滑膜組織及鄰近區域富集著大量RANK表達陽性的破骨樣細胞(Osteoclast-like cell，OLC)，與局部骨侵蝕密切相關[9]。那么，與一般人群相比，RA患者體內OC的分化情況是否有所不同呢？本研究將RA患者外周血單核細胞作為研究對象，通過外周血單核細胞誘導培養法建立OC培養體系，通過TRAP染色及骨吸收陷窩實驗對OC進行鑒定，結果顯示該方法能誘導培養出功能成熟的OC。觀察RA患者外周血OC的分化情況，與正常人群進行對比發現，兩組外周血單核細胞誘導生成的OC形態相似，RA患者外周血OC生成的數量明顯增加，骨吸收功能明顯增強，這與Durand等[10]的研究結果相一致，提示RA患者外周血OPC向OC的分化能力增強。在RA患者中，一方面炎性細胞因子直接或間接誘導OC分化并促進其功能[11]；另一方面RA相關自體抗體不僅引起自身免疫復合物的形成而導致滑膜炎的發生，而且能與OPC結合直接促進骨丟失[12]。

國內外相關研究多采用影像學分級對RA患者的手、腕關節局部骨質破壞進行評估，其中Van等[5]修訂的Sharp評分最為常用。BMD的測定可一定程度上反映RA患者全身骨丟失的情況。為進一步探究RA患者OC分化能力增強與RA骨破壞的關系，本研究通過Sharp評分和BMD檢測評估RA患者骨破壞的情況，并與這些患者外周血誘導生成的OC數量進行相關性分析，結果顯示RA外周血生成的OC數量與Sharp評分呈顯著正相關，與BMD(T值)呈顯著負相關，提示RA外周血生成OC的數量及功能與RA關節骨破壞和骨丟失的嚴重程度密切相關。本研究尚存在不足之處，因實驗時間及經費的局限性，采集的RA患者及健康志愿者的樣本量較少，后期應當進一步完善。

綜上所述，RA患者外周血OPC向OC的分化能力增強，且與RA關節骨破壞和骨丟失的嚴重程度密切相關，然而其內在機制尚未完全闡明，關于RA骨破壞機制的研究還需更深入的探索。