丹參水提液對碘乙酸鈉所致大鼠骨關節(jié)軟骨退變的預防作用

閔亞林，姜思羽，吳迪生，陳文雙，許碧蓮,

(廣東醫(yī)科大學1. 藥理學教研室、2. 廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 湛江 524023)

骨性關節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是由創(chuàng)傷、肥胖、衰老、遺傳等許多因素引起的關節(jié)軟骨損傷退化、軟骨下骨及關節(jié)增生的一種退行性病變[1]。據(jù)統(tǒng)計報道，肥胖和人口老齡化常常伴隨著OA的產(chǎn)生，男性的患病率往往低于女性，OA影響著越來越多的人[2]。據(jù)預測，到2020年，OA將是40歲人群發(fā)病和身體局限的主要原因。如何防治OA，是人們亟待解決的難題。丹參是天然的傳統(tǒng)中藥，具有抗炎、抗菌、抗氧化等藥理作用，特別是對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)有較強的藥理活性，主要含有脂溶性成分丹參酮和水溶性成分丹參酚酸、丹參素等[3]。有研究表明，丹參酮防治OA可能是通過提高軟骨細胞的活性，對抗氧自由基來防止軟骨的破壞[4]。文獻報道[5-6]，丹參注射液可以抑制體外兔軟骨細胞凋亡，關節(jié)腔注射丹參注射液治療OA，可以緩解膝關節(jié)軟骨退變。丹參水提液(water extract of Danshen, DWE)是否可防治大鼠OA，尚未見報道。因此，本實驗采用關節(jié)腔內(nèi)注射碘乙酸鈉(monosodium iodoacetate, MIA)建立大鼠OA模型，通過ELISA法、組織病理學、Micro-CT等技術，探討DWE對MIA所致大鼠骨關節(jié)軟骨退變的預防作用，為OA的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級6月齡SD ♀大鼠27只，體質(zhì)量(286±19)g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK 桂 2014-0002。開始實驗前適應性飼養(yǎng)1個月，實驗時平均體質(zhì)量為(295±22)g。每周稱量體質(zhì)量1次，且稱量前1 d禁食、不禁水。

1.2藥物與試劑MIA(貨號：305-53-3，批號：19148)，購自美國Sigma公司，避光稱量120 mg MIA粉末于5 mL無菌EP管中，加入3 mL生理鹽水，配成濃度為60 g·L-1MIA溶液(造模前1 d配制，避光保存于4 ℃?zhèn)溆?。丹參購自黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，批號：D7020305，將一定的丹參藥材與單蒸水煎煮，濃縮成一定體積，以丹參素為含量計算，得到的DWE含丹參素濃度為1～1.2 g·L-1。基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13, MMP-13)ELISA試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；白介素6(interleukin 6, IL-6)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)ELISA試劑盒，均購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；改良番紅O-固綠軟骨染色液，索萊寶科技有限公司。

1.3儀器石蠟切片機(德國Leica公司)；光學顯微鏡(日本Nikon公司)；viva Micro-CT 40(瑞士SCANCO Medical AG)；AE240電子天平(梅特勒·托利多儀器公司上海分公司)。

Tab 1 Body weight changes of rats in each experimental n=9)

1.4方法27只♀ SD大鼠隨機分為3組，每組9只，分別為：假手術組(Sham)、MIA組、DWE組。Sham組在大鼠左側膝關節(jié)腔內(nèi)注入生理鹽水50 μL，MIA與DWE組在大鼠左側膝關節(jié)腔內(nèi)注入MIA溶液50 μL[7]。注射MIA后d 2開始灌胃給藥，Sham與MIA組給予生理鹽水5 mL·kg-1， DWE組給予DWE 5 mL·kg-1。所有大鼠每天灌胃1次，連續(xù)給藥6周，每周稱體質(zhì)量1次，并按大鼠體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量。實驗結束，麻醉后心臟采血處死，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∽髠让劰呛凸晒怯?0%中性甲醛固定12 h，換70%乙醇保存，備用。

1.5血清相關指標的檢測采用ELISA法檢測血清中MMP-13、IL-6、TNF-α水平，具體方法按照試劑盒說明書操作。

1.6Micro-CT檢測掃描前，取脛骨浸泡于顯影液中，水浴鍋恒溫(37 ℃)浸泡20 min進行掃描。掃描參數(shù)為：圖像矩陣為2 048×2 048×223，整合時間為200 ms，能量/強度為45 kVp、177 μA、8 W，以1 200 mg HA/cm校正CT值，0角度旋轉，進行掃描。掃描完成后，用Micro-CT自帶軟件對骨組織重組圖像進行三維旋轉，以確保橫向軸與垂直軸對齊，進行定量分析內(nèi)側關節(jié)面軟骨厚度時，選取以正中心前后各2.0 mm，共層厚4.0 mm的關節(jié)組織為測量區(qū)域(regional of interest, ROI)進行三維圖像重組，以最低閾值為170提取圖像信息。在對應的關節(jié)面ROI下對軟骨以及軟骨下骨小梁進行三維圖像重組。可得到以下參數(shù)：軟骨體積(cartilage volume)、軟骨厚度(cartilage thickness)[8]。分析重建后的軟骨體積和軟骨厚度，可以反映軟骨的破壞程度。軟骨體積越小、厚度越薄，則表示軟骨退化、結構破壞越嚴重。

1.7番紅O-固綠軟骨染色檢查將股骨脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋，4 μm厚度的組織切片備用。將股骨石蠟切片經(jīng)過烤片、脫蠟、染色、封片，得到番紅O-固綠染色組織片[9]。做OARSI(Osteoarthritis Research Society International, OARSI)病理學評分[10]。

2 結果

2.1各組大鼠一般狀態(tài)和體質(zhì)量變化在進行OA造模時，關節(jié)腔注射MIA的大鼠膝關節(jié)從進針處開始出現(xiàn)紅斑，腫脹現(xiàn)象隨時間逐漸蔓延到整個膝關節(jié)，關節(jié)出現(xiàn)紅腫熱痛，大鼠行動減少，左后肢屈縮、跛行，進食量下降，精神萎靡，體質(zhì)量下降。注射生理鹽水的大鼠起初會出現(xiàn)紅斑，但數(shù)小時后紅斑消退。1周后，大鼠精神狀態(tài)和進食慢慢恢復，隨著給藥的進行，DWE組的腫脹程度較MIA組輕，活動較MIA組靈敏，Sham組大鼠膝關節(jié)無腫脹且活動靈敏。整個實驗過程中，除了造模后的1周體質(zhì)量有所下降，各組大鼠的體質(zhì)量都有所增加，但是體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(Tab 1)。

2.2各組大鼠血清生化指標的變化由Fig 1可見，與Sham組相比，MIA組血清MMP-13水平明顯升高(P<0.01)，IL-6和TNF-α有上升的趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與MIA組相比，DWE組的MMP-13水平明顯降低(P<0.05)，IL-6和TNF-α有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3各組大鼠脛骨關節(jié)面內(nèi)側軟骨Micro-CT的變化

2.3.1各組大鼠脛骨關節(jié)面內(nèi)側軟骨Micro-CT定量參數(shù)的變化 由Fig 2可見，與Sham組相比，MIA組的軟骨厚度和軟骨體積均明顯減小(P<0.01)；與MIA組相比，DWE組的軟骨厚度和軟骨體積均明顯增加(P<0.01，P<0.05)。

2.3.2各組大鼠脛骨關節(jié)面內(nèi)側軟骨Micro-CT的二維、三維圖結構變化 由脛骨內(nèi)側軟骨Micro-CT的二維圖與三維圖可見(Fig 3)，與Sham組相比，MIA組軟骨厚度明顯變薄；與MIA組相比，DWE組的軟骨厚度有所增厚。

2.4各組大鼠股骨內(nèi)側關節(jié)軟骨番紅O-固綠染色變化番紅O-固綠染色結果顯示(Fig 4)，Sham組關節(jié)軟骨無骨關節(jié)炎表現(xiàn)，表面完整、平滑，軟骨細胞排列正常，數(shù)量正常，核染正常，軟骨基質(zhì)著色鮮紅；MIA組關節(jié)面糜爛、缺損、變形，損傷占比超過50%，軟骨結構消失，軟骨層進行性喪失或者損壞，軟骨細胞數(shù)量減少，排列紊亂，有簇集現(xiàn)象，軟骨基質(zhì)著色變淺；DWE組損傷占比在10%～25%之間，軟骨表面稍不平整，局部出現(xiàn)軟骨細胞簇集，細胞數(shù)量減少，基質(zhì)著色變淺。將染色的組織片經(jīng)過OARSI病理學評分，結果如Fig 5所示，與Sham組比較，MIA組大鼠股骨關節(jié)面軟骨OARSI病理學評分明顯提高(P<0.01)；與MIA組比較，DWE組大鼠關節(jié)面軟骨OARSI病理學評分明顯降低(P<0.01)。

Fig 1 Changes in serum biochemical parameters of rats in each n=8)

**P<0.01vssham group;#P<0.05vsMIA group

Fig 2 Changes of medial cartilage thickness in tibia and articular surface of rats in each

**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsMIA group

3 討論

隨著人口老齡化問題的突出，OA已成為提高中老年人生活質(zhì)量的一大障礙，因此，建立合適的動物模型來研究OA非常重要。本實驗通過關節(jié)腔內(nèi)注射MIA誘發(fā)OA模型，手術簡單方便、造模時間短、造模穩(wěn)定、受其他因素干擾少，且造成關節(jié)漸進性退變[11]。從大鼠脛骨關節(jié)面內(nèi)側軟骨的Micro-CT結果可以看出，與Sham組相比，MIA組的軟骨厚度明顯變薄，軟骨體積減少，提示關節(jié)腔內(nèi)注射MIA可導致大鼠脛骨關節(jié)面軟骨退化和結構破壞。從大鼠股骨關節(jié)面內(nèi)側軟骨番紅O-固綠染色的組織切片及病理學評分結果可以看出，MIA組關節(jié)面糜爛、缺損、變形，損傷占比超過50%，軟骨結構消失，軟骨層變薄，軟骨細胞數(shù)量變少，排列紊亂，有簇集現(xiàn)象，軟骨基質(zhì)著色變淺。與Sham組相比，MIA組的OARSI病理學評分明顯提高，提示關節(jié)腔內(nèi)注射MIA可導致大鼠股骨關節(jié)面軟骨退化和結構破壞。結果進一步說明，大鼠關節(jié)腔內(nèi)注射MIA可以誘發(fā)OA。MIA能使軟骨細胞凋亡、軟骨基質(zhì)降解，是一種甘油醛-3磷酸脫氫酶抑制劑[12]。在大鼠關節(jié)腔注射MIA后，會導致關節(jié)軟骨出現(xiàn)損傷，出現(xiàn)軟骨蛋白多糖基質(zhì)的丟失和關節(jié)功能障礙等類似于人類OA發(fā)病時的癥狀[13]。MIA可能活化caspase-3來誘導大鼠軟骨細胞凋亡[14]，但是其確切的機制尚未明確。

Fig 3 Micro-CT 2D map and 3D map of medial cartilage thickness of each group

Fig 4 Histopathological observation of femoral medial articular cartilage in each group(Safranine O-fixed green staining,×200)

A: Sham; B: MIA; C: DWE.

Fig 5 OARSI score of femoral medial

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsMIA group

由大鼠脛骨關節(jié)面內(nèi)側軟骨的Micro-CT結果可以看出，DWE組的軟骨厚度和軟骨體積均比MIA組明顯增加，提示DWE可延緩MIA所致大鼠脛骨關節(jié)面的軟骨退化和結構破壞。從大鼠股骨關節(jié)面內(nèi)側軟骨番紅O-固綠染色的組織切片及病理學評分結果可以看出，DWE組損傷占比在10%～25%之間，軟骨表面稍不平整，局部出現(xiàn)軟骨細胞簇集，細胞數(shù)量變少，基質(zhì)著色變淺。此外，DWE組OARSI病理學評分明顯比MIA組低，提示DWE可延緩MIA所致大鼠股骨關節(jié)面的軟骨退化和結構破壞。結果進一步說明，DWE對MIA所致大鼠骨關節(jié)軟骨退變有一定的保護作用。

由血清檢測結果可見，DWE組的MMP-13水平比MIA組低，提示丹DWE延緩MIA所致大鼠骨關節(jié)軟骨退化的作用可能與抑制MMP-13有關。文獻報道，丹參注射液減輕軟骨損傷可能是通過修正在OA軟骨組織中MMP-9和TIMP-1的異常表達[5]，也可能是通過抑制軟骨細胞線粒體調(diào)亡通路信號轉導，進而抑制其凋亡[6]。但是DWE的確切作用機制，還有待于深入研究。丹參分為脂溶性和水溶性兩大類成分，水溶性成分主要為酚酸類化合物，具有改善微循環(huán)、增強耐缺氧能力、保護腦組織缺血/再灌注損傷、抗炎、抗氧化等藥理活性。此外，丹參水溶性成分還可通過抗氧化應激作用而調(diào)節(jié)骨代謝[15]。文獻報道，氧化應激在MIA誘導大鼠軟骨細胞凋亡過程中起著重要的上調(diào)作用[14]。DWE防治大鼠OA的作用是否與其抗氧化應激作用有關，還有待于深入研究。