殼聚糖微球制備及其應用研究進展

郭亮亮，劉澤員，張靜

(鄭州大學 化工與能源學院，河南 鄭州 450001)

殼聚糖價廉易得，且具有止血、抑菌、抗癌等多種生理功能，且無毒、無刺激、可自然降解[1]，這使得殼聚糖得以被廣泛應用。在腫瘤治療[2-3]、組織工程[4-6]、藥物遞送[7-10]、水處理[11-13]、食品包裝[14-16]等方面，殼聚糖均有被研究及應用；此外殼聚糖在其它方面[17]也有應用。

由于優異的止血性能，殼聚糖類止血材料成為近幾年止血材料的研究熱點之一。有研究表明，殼聚糖某些衍生物在水溶性、止血性等方面優于殼聚糖。將殼聚糖特定衍生物制成微球，可提高其比表面積等參數。本文綜述殼聚糖復合微球的幾種制備方法及其在止血、抗癌、藥物遞送、藥物緩釋方面的應用。

1 殼聚糖復合微球制備方法

1.1 反相乳化法

反相乳化法是乳化法中的一種，常與其它方法結合使用。反相乳化法是指以殼聚糖溶液為分散相，液體石蠟、石油醚等為連續油相，配制成油包水(W/O)的殼聚糖乳劑，再根據要求加入定量戊二醛等交聯劑或通過其它方式進行固化，分離干燥得到殼聚糖微球。其中戊二醛與殼聚糖交聯的反應機理見圖1[18]。

薛海燕等[19]應用該方法制備出了以殼聚糖和丙烯酸為主要基材的改性殼聚糖復合微球，復合微球的力學性能、規整程度受到基材比例、攪拌速率、反應溫度、中和度、水油比、乳化劑用量以及乳化時間等因素的影響，后續的花青素吸附實驗[20]中，在優化后的條件下，吸附率可達95.60%，這表明了復合微球對花青素吸附的可行性。反相乳化法的優點是毋庸置疑的，例如所包裹的藥物不受親水性、親油性限制，反應條件、操作流程簡單易行且所制備的微球外形規整、大小均一，但其也有一定的不足之處，比如反應所需的交聯劑大都有一定毒性，此外交聯劑還會致使某些藥物失去活性。因此低毒性交聯劑成為了研究人員的關注點。

圖1 戊二醛與殼聚糖交聯的反應機理Fig.1 Reaction mechanism of cross-linking of glutaraldehyde with chitosan

1.2 離子交聯法

離子交聯法是指根據殼聚糖在酸性條件下表面帶有正電荷，而一些聚離子如三聚磷酸鈉帶負電荷的特性，控制適當條件，使得二者通過分子間的靜電作用相互交聯形成網狀或體形而生成殼聚糖微球的方法。三聚磷酸鈉與殼聚糖交聯的原理圖見圖2。

圖2 三聚磷酸鈉與殼聚糖交聯的原理圖Fig.2 Schematic diagram of cross-linking of sodium tripolyphosphate and chitosan

Tan等[21]結合離子交聯法和噴霧干燥法，制備了負載有阿莫西林的納米殼聚糖微球，微球中的殼聚糖與阿莫西林相互作用，顯著增強了后者的抗菌性，復合微球的MIC值比阿莫西林低3倍。該方法所需反應條件溫和，操作簡單。其最大優點在于避免了有毒副作用的交聯劑的使用，用于藥物包裹等醫藥領域時，能夠最大限度保留藥物活性甚至一定程度上起到增強作用。但此方法制得的微球機械強度較差，規整程度有待提高。

1.3 噴霧干燥法

噴霧干燥法是指通過一種霧化器，將液體物料霧化成小液滴，混入熱風中，使液滴中的溶劑瞬間揮發進而形成微球的方法。Mishra等[22]結合離子交聯與噴霧干燥兩種方法，制備出包封兩種抗生素(鹽酸多西環素、左氧氟沙星鹽酸鹽)的殼聚糖聚電解質復合物微粒，該微粒緩釋效果優良、靶向效率高且沒有明顯細胞毒性。通過噴霧干燥制備的殼聚糖聚電解質復合物微粒適合作為替代載體，用于吸入類藥物來遞送抗生素。該方法要求熱風不與液體物料反應，對于熱敏型物料不適用。該方法中的原料液濃度、氣流速度、進口氣流溫度均對產品質量有影響。噴霧干燥是目前最適合大規模生產的一種方法，應用前景廣泛。

1.4 凝聚法

由于殼聚糖單體環上存在氨基基團且其在酸性條件下易發生質子化，這使得殼聚糖表面存在正電荷而溶于弱酸。凝聚法就是利用這個特點，通過降低殼聚糖在溶液中的溶解度，析出沉淀進而來制備微球。復凝聚法是凝聚法中的一種，適合用于制備親水性藥物微球。單凝聚法與復凝聚法的區別在于，單凝聚法是利用物理或化學等手段降低殼聚糖溶解度而將其析出來制備微球，而復凝聚法是利用另一種帶有負電荷的高分子材料與殼聚糖相互交聯共同沉淀制備微球。Kim等[23]通過含有陰離子的黃原膠與含有陽離子的殼聚糖相互凝聚，制備了殼聚糖-黃原膠微球，該微球體外釋放為非Fickian擴散，對人真皮層纖維細胞無毒性且對牙齦卟啉單胞菌生長有選擇性抗菌作用，動物模型試驗有待進一步進行。凝聚法具有一定的優勢，在反應過程中不需要使用額外的溶劑，避免了溶劑殘留可能造成的毒性；但其仍有不足之處，包封率低、釋放速率快等問題有待解決[24]。

2 殼聚糖復合微球制備及應用

2.1 止血方面

血液凝固的“瀑布學說”由MacFarlane、Davies和Ratnoff于1964年提出，該學說將血液凝固過程大致分為凝血酶原激活物形成、凝血酶形成、纖維蛋白形成三個階段，被廣泛認同[25]。目前使用的止血藥物也都是通過激發血液凝固瀑布機制中某一環節[26]。殼聚糖止血大致分為三種方式：①殼聚糖本身的陽離子特性以及其本身結構和分子量，可使得紅細胞大量吸附紅細胞而止血；②殼聚糖的正電特性刺激血小板，后者活化后不僅能迅速在殼聚糖表面聚集形成血凝塊，而且進一步發生凝聚，使凝塊更牢固；③殼聚糖由于其本身獨特的分子結構，能通過在體內的一系列生化反應后，結合幾乎所有的主要血漿蛋白，及一些重要的凝血因子,從而起到進一步牢固血凝塊的作用[27]。近年來殼聚糖在止血方面的應用研究發展迅猛。

Li等[28]把反相乳化法與熱致相分離法結合起來，以殼聚糖的醋酸溶液為分散相，石油醚為連續相，司盤80和吐溫60為表面活性劑，NaOH、乙醇的水溶液為相轉化液，制得多孔殼聚糖微球。該微球的表面積、孔隙率、吸水率分別為28.2～31.5 m2/g、 98%、15.5～23.2 g/g，表面孔徑在2.0 μm以下。大鼠肝切口模型實驗表明，多孔殼聚糖微球與普通殼聚糖微球相比，止血時間大大縮短，失血量顯著降低。組織學測試表明，在肝臟裂傷的應用中，多孔殼聚糖微球具有良好的生物相容性及生物活性。

Sun等[29]同樣結合反相乳化和熱致相分離兩種方法，在殼聚糖溶液中加入高嶺土，司盤80為乳化劑，乙醇為反相溶液，其它步驟與制備多孔殼聚糖微球相同，制備出殼聚糖/高嶺土多孔復合微球。與純殼聚糖多孔微球相比，殼聚糖/高嶺土多孔復合微球在大鼠尾截肢和肝裂傷模型中的止血時間均有明顯降低。全凝血動力學表明，在相同時間內，與純殼聚糖多孔微球、市售celox止血王(速效止血粉)相比，多孔復合微球所形成的血塊更大。其研究結果表明，多孔復合微球有作為快速止血劑，用于創傷止血的巨大潛力。

Pan等[30]以Li、Sun等的研究為基礎，在制備多孔殼聚糖微球的過程中，向乳液中添加含有β-(1，4)-甘露糖醛酸酯(M)和α-L-古洛糖醛酸酯(G)單元嵌段的陰離子天然聚合物(SA)溶液、ZnCl2溶液，制備出了含鋅離子的多孔殼聚糖微球。與純殼聚糖多孔微球相比，在大鼠肝裂傷和尾切除模型中，CS@ZnAlg微球的血液凝塊更大、凝血時間更短、出血量更短。孫雙等[31]采用離子交聯法，將葉酸與月桂酸鈉的二甲基亞砜共溶液加入到O-羧甲基殼聚糖的醋酸-醋酸鈉緩沖液溶液中進行反應，獲得葉酸-O-羧甲基殼聚糖 (FA-O-CMCS)復合微球。經檢測，該微球結構穩定，粒徑在0.9～1 μm，比較均勻。最后采用斷尾取血法探究FA-O-CMCS復合微球的凝血、止血性能，結果顯示，凝血、止血時間分別為139 s和266 s，效果顯著。

2.2 藥物載體方面

殼聚糖安全無毒、可降解、生物相容性良好，是一種天然聚陽離子多糖，可根據其具有正電荷這一特性將其制備成微球，并負載或者包裹目標藥物，用于止血、疾病治療等方面。近年來，殼聚糖微球作為藥物載體一直是人們的研究熱點。

2.2.1 抗癌 殼聚糖抗癌有兩種形式：第一，殼聚糖本身具有抗癌活性；第二，殼聚糖作為藥物載體負載或包裹抗癌藥物實現抗癌。對于第一種形式，殼聚糖可通過直接作用于腫瘤細胞，抑制其生長，誘導癌細胞凋亡，調節和增強機體免疫功能三種途徑實現抗癌作用[32]。對于第二種形式，殼聚糖經常被用于包裹或負載抗癌活性藥物實現抗癌，近年來研究較多。

Anitha等[33]首先將殼聚糖制備成N,O-羧甲基殼聚糖(N，O-CMC)，隨后通過離子交聯法，在恒速攪拌下將離子交聯劑三聚磷酸鈉(TPP)加入到N，O-CMC溶液中，首先制得N，O-CMC納米微粒。進一步地，在連續攪拌條件下，向N，O-CMC溶液中逐滴加入姜黃素的乙醇溶液，之后再加入TPP，得到負載姜黃素的納米N,O-羧甲基殼聚糖微粒。這些微球平均直徑(150±30)nm分布，為球形狀態，MTT測試表明，該微球對正常細胞無毒，并對癌細胞有特異毒性。同年Anitha等[34]還開發了負載5-氟尿嘧啶的N，O-羧甲基殼聚糖納米顆粒，并進行了抗癌活性研究，與常規化療相比，該顆粒不僅顯示出了乳腺癌細胞的毒性，而且副作用很低，血液相容性良好，藥物包封率達65%。

殷啟風等[35]也利用該方法，制備出包裹C-藻藍蛋白的納米微球(C-PC/CMC-NPs)。該納米微球形狀規整，平均粒徑為120 nm。進一步地，他們又在C-PC/CMC-NPs上負載CD59sp(CD59 配體)，從而制備出羧甲基殼聚糖包裹C-藻藍蛋白負載CD59 配體的靶向納米微球(C-PC/CMC-CD59sp-NPs)。MTT測試表明，該微球在體外對HeLa 細胞增殖有明顯的抑制作用，具有良好的靶向性。在適宜pH條件下，120 h內釋放率可達80%，并且無溶血現象發生。

Sriram等[36]通過離子交聯法制備出負載有CuO-姜黃素的殼聚糖-苯丙酮復合載藥微球，該微球的藥物釋放遵循非Fickian定律。由于殼聚糖中的芳基酮以及親水性納米CuO的存在，姜黃素得以有效釋放。他們研究了所制備微球對M19-MEL、MCF-7和HeLa的抗癌活性，結果顯示復合微球的抗癌活性與游離苯丙酮相當，其IC50值為12～19 μg/mL，抗癌活性顯著。

2.2.2 藥物遞送 藥物遞送系統系采用多學科的手段將藥物有效地遞送到目的部位，與傳統制劑相比，其可以提高藥物穩定性，減輕藥物毒副作用，提高藥物利用率，在靶向區維持所需藥物濃度，目前已發展建立了多種類型的新型藥物遞送系統[37]。

Yan等[9]以三價鋁離子為交聯劑，使用離子交聯法制備了羧甲基殼聚糖/聚谷氨酸復合微粒(CMCS/PGA)，性能測試結果表明，CMCS/PGA復合微粒的溶脹性能對pH值敏感，CMCS微球的親水性隨著PGA的引入大大提高。隨后的研究中，又將親水性藥物左氧氟沙星(LFX)封裝為模型藥物以測試CMCS/PGA復合微粒的包封性能和體外釋放性能，結果表明，CMCS/PGA復合微粒的體外釋放性優異，持續給藥，包封率達到28.6%，是理想的藥物遞送載體。

王大衛等[38]采用噴霧干燥法，以殼聚糖及兩種提取物原花青素、白芨多糖為原料，制備出了原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球。經一系列表征得，粒徑分布在2～15 μm之間，形狀規整，有良好的溶脹特性，具有緩釋作用，有望成為肺吸入給藥的良好載體。

李納等[39]將離子交聯法與噴霧干燥法結合起來，首先制備出姜黃素磷脂復合物(Cur-PS)水分散液，再將殼聚糖的醋酸溶液與之混合均勻，在攪拌條件下將三聚磷酸鈉逐滴加入到混合液中，靜置后經噴霧干燥制得姜黃素磷脂復合物殼聚糖微球。該微球呈表面光滑的完整球形，平均粒徑可低至(5.19±0.4)μm，有望用于肺部給藥。

2.2.3 藥物緩釋 在日常傷口處理以及臨床給藥方面，時常會有持續給藥的要求，多次給藥會造成病人痛苦，增加成本。緩釋藥物能有效減少給藥次數，控制藥物釋放速率，延長藥物作用時間，維持有效的藥物濃度，降低藥物的毒副作用[40]，增加病人的順應性。殼聚糖理化性質優良，可被制成藥物載體用于藥物緩釋。Webber等[41]將殼聚糖添加到醋酸溶液中，攪拌至溶解，加入蒸餾水稀釋后將其加入到還原型谷胱甘肽(GSH)的水溶液中，調節相關參數，經噴霧干燥器制得包裹有GSH的殼聚糖微球，該微球表面光滑，具有一定的緩釋性能。

Helbling等[42]結合離子交聯法和噴霧干燥法，將不同質量分數的黃體酮分散到殼聚糖的醋酸溶液，并加入合適量的乳化劑吐溫80，攪拌均化，將交聯劑三聚磷酸鈉(TPP)逐滴加到均化后的溶液中，調節干燥器的進口溫度、液體流量、干燥空氣流量等參數，經噴霧干燥制得包裹黃體酮的殼聚糖微粒。經過測試，所制備的復合殼聚糖微球平均粒徑分布在1～7 μm之間。復合殼聚糖微球的球形度隨著乳化劑用量的增加而增加，隨著交聯劑的增加而減小，對黃體酮的包封率在69%～75%之間。在中性的緩沖溶液中，黃體酮持續釋放，這為黃體酮在人體內的持續給藥提供了可能。

Unagolla等[7]應用凝聚法，首先配制低分子量殼聚糖的乙酸溶液，過濾后加入萬古霉素溶液并攪拌，完全溶解后將混合溶液滴加到三聚磷酸鈉溶液中，以一定速度攪拌2 h，過濾后室溫下風干過夜制備出包裹萬古霉素的殼聚糖微球。同時，他們用該方法制備了包裹萬古霉素的殼聚糖-藻酸鹽微球。首先，配制殼聚糖、氯化鈣的共溶液，加入萬古霉素溶液并攪拌，連續攪拌下將共混液逐滴加入海藻酸鹽/TPP溶液中，一段時間后將所得顆粒于室溫風干過夜。經表征測試得，微球表面粗糙，均勻分布。其中，經凍干獲得的萬古霉素的殼聚糖-藻酸鹽微球具有最優良的控釋性能，該微球平均每天釋放萬古霉素22 μg，且持續長達14 d。萬古霉素的釋放速率并未隨藻酸鹽濃度增加而增加。

Xin等[43]首先將明膠與海藻酸鈉水溶液均勻混合，加入定量大蒜素油，均質后將乳化液逐滴加入到氯化鈣溶液中，隨后將所得微球加入到殼聚糖溶液中，可得大蒜素/海藻酸鈉/明膠/殼聚糖復合微球。經測試表征，微球粒徑在0.8～0.9 mm 之間分布，形狀規則，對pH敏感，具有良好緩釋性能，且明膠的加入可延長藥物緩釋時間。

Scalera等[10]配制不同濃度殼聚糖溶液并加入聚山梨酯80作為表面活性劑，將過濾后的氫氧化鈉溶液逐滴加入到殼聚糖溶液中，得到殼聚糖微球。該微球平均直徑在150～400 nm范圍內，其中最小的微球在水溶液中能夠穩定存在3 d，說明該微球可用于短時間藥物遞送。

3 展望

近年來殼聚糖因其優異的特性、低廉的價格已得到廣泛研究，在生物、醫學、水處理、食品包裝等諸多領域均有應用，但進一步的精細研究必不可少。新型止血材料的研究日漸增多，發展迅速，市場上已存在各種劑型的止血材料，但一些不足之處例如經濟性、生物相容性、持久性、應用范圍受限等依然存在，尤其是不可擠壓止血的體內大面積出血，目前仍沒有有效的止血材料可以解決此類問題，這都是我們努力的方向。殼聚糖微球近幾年成為止血材料的研究熱點，多孔殼聚糖微球、殼聚糖復合止血微球因其優良性能脫穎而出。然而對于這類材料來說，只擁有止血、無毒這些性能是遠遠不夠的，優良的降解性能也是止血材料所必備的特性。此外，止血材料不僅不能引起炎癥等不良反應的發生，而且在止血的同時，其本身也應具備抗菌性，防止感染的發生。再者有些傷口如燒傷創面的愈合是無法在短時間內完成的，這就要求止血材料具有長效止血、長效抑菌的特性。所以將可降解、具有更強止血性能的殼聚糖衍生物制備成緩釋微球將是今后止血材料的發展方向。