液相色譜—質譜法測定血藥濃度試驗中提高靈敏度的方法概述

摘 要 血漿中藥物（或內源性物質）濃度檢測是藥代動力學的基礎，也是藥物臨床前和一期臨床研究重要組成部分，還是一些疾病和胎兒早期篩查的重要指標。目前血漿中藥物濃度檢測廣泛采用液相色譜-質譜法（LC-MS/MS）。而LCMS/MS測定過程中，常遇到藥物的檢測靈敏度不夠的問題。檢測靈敏度不夠主要是由于藥物濃度過低或藥物結構質譜響應低造成的。本文概述了LC-MS/MS法血藥濃度檢測中提高靈敏度的主要途徑，即根據藥物結構，從質譜方法、色譜方法、樣品制備方法和避免低濃度樣品污染四個方面來聯合提高藥物檢測靈敏度的解決方案，從而為解決血漿中藥物檢測靈敏度不夠的困難提供幫助。

關鍵詞 LC-MS/MS 低靈敏度 超低濃度

中圖分類號：O657； R969.1 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）05-0074-05

An over view of methods for improving sensitivity in the determination of plasma drug concentration by liquid chromatography-mass spectrometry

MA Zhiyu1，2*（1. Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China； 2. Shanghai Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT The determination of drug （or endogenous substance） concentration in plasma is the basis of pharmacokinetics， an important component of preclinical and phase I clinical studies and also an important indicator of some diseases and early fetal screening. At present， the determination of drug concentration in plasma is mainly performed by liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS/MS）. The most difficult problem often encountered in the LC-MS/MS analysis is the one of insufficient sensitivity of drug determination， which is mainly due to the low drug concentration or the low response of the drug structure to mass spectrometry. This paper outlines the main ways to improve the sensitivity of LC-MS/MS for the determination of plasma drug concentration， and the solutions to improve drug determination sensitivity are described based on the drug structure from four aspects such as the mass spectrometry method， chromatographic method， sample preparation method and avoidance of low concentration sample contamination so as to provide helps for solving the difficulty of insufficient sensitivity of drug determination in plasma.

KEY WORDS LC-MS/MS； low sensitivity； ultra-low concentration

測定血藥濃度是研究藥代動力學的基礎，而動物和人的藥動學研究是藥物臨床前研究和一期臨床安全性評價重要組成部分，是新藥上市之前研發必由之路，同時還是疾病和胎兒早期篩查的重要途徑。由于血漿中含有血漿蛋白、鹽離子、水分和待測藥物等復雜組分，且其中藥物濃度相對較低，而液相色譜-質譜法（LC-MS/ MS）集分離和檢測技術為一體，能把藥物從體內大多數復雜物中分離出來進行測定，故成為目前測定血漿中藥物濃度的主要方法[1-6]。

藥物血漿濃度檢測中，由于檢測靈敏度不夠而不能滿足測定要求是最常見的問題[7-8]。其原因一方面是待測藥物血漿中濃度過低，另一方面是藥物本身結構響應低或質譜離子化不穩定，比如某些類固醇類藥物不含質譜響應基團或某些藥物（如魚腥草素）質譜中裂解[3-6，9]。以上的兩種問題都需要提高儀器對藥物檢測靈敏度來滿足測定要求。本文將對LC-MS/MS法測定血漿中藥物如何提高檢測靈敏度的方法進行概述，為該類藥物的血漿濃度測定提供參考，從而為藥物研發提供幫助。在建立液相色譜-質譜儀（LC-MS/MS）測定血漿中藥物方法時，一般從三方面進行優化：質譜方法、色譜方法和樣品制備方法。本文將分別從這三個方法來概述建立此類方法的具體注意事項。

1 質譜方法

待測藥物在質譜儀測定時的響應往往和藥物本身的化學結構、質譜儀所用離子源、質譜儀相關參數和待測藥物形成的加和離子類型或裂解離子等因素有關[7-12]。

1.1 離子源類型

目前的液相色譜-質譜儀（LC-MS/MS）通常有三種離子源：ESI源（電噴霧離子化源）、APCI源（大氣壓化學電離源）和APPI源（大氣壓光電離源）。而在藥學領域，主要應用ESI源和APCI源。它們使藥物離子化的方式不同，ESI源是使藥物在液體狀態下帶電，APCI源是使藥物在氣體狀態下離子化。故而ESI源適合于大多數有一定極性的藥物，而APCI源則適合極性較弱的氣體狀態不容易裂解的藥物。當藥物化學結構極性相對較大時，往往優先選用ESI源；但藥物極性較小時，APCI源則因為測定時儀器響應穩定而更加有優勢[7-8]。

1.2 質譜相關參數

質譜相關參數包括三種類型：質譜硬件狀態、質譜系統參數和藥物自身質譜參數[7-8，11-14]。

質譜硬件狀態主要是指噴霧針相對位置，在調試時，可通過噴霧針的微調旋鈕來對噴霧進行調節，以獲得最佳的質譜響應值。噴霧針相對位置往往和流動相流速和組成相關。

質譜系統參數包括噴霧電壓、氣化溫度、霧化器壓力和溫度、反吹氣壓力和溫度等。這些參數的調試要結合試驗的色譜方法來進行，例如流動相流速大或水相占比高，氣化溫度、霧化器壓力和溫度等參數就要相應的提高，以保證流動相被完全噴散并霧化，從而增大儀器響應值。而反吹氣則是在儀器背景噪音較高，樣品基質相對較臟時使用，可降低背景噪音，從而提高相對靈敏度。在進行多個藥物同時測定時，以上參數應以濃度最低或檢測靈敏度最低藥物為基準。

藥物自身質譜參數主要包括去簇電壓和碰撞能量。這兩個參數僅與藥物本身結構和碎片離子結構有關，故在優化完之后，質譜色譜系統方法再改變對此兩個參數影響都不大。此外，由于大多數串聯質譜都不是高分辨質譜，故而可通過調整分子量后面小數點來選擇母離子和子離子，從而優化質譜響應值[10]。

1.3 加和離子和裂解離子

大部分藥物在質譜中都能得到準分子離子峰，即[M+H]+峰。但也有不少藥物得不到[M+H]+峰或者[M+H]+峰相對于其他加和峰響應值小很多，這時就需要選擇加和離子峰作為其母離子來進行檢測，以提高響應值。常見的加和峰可分為正電模式，如[M+NH4]+，[M+Na]+，[M+Li]+，[M+K]+和負電模式，如[M+Cl]？，[M+HCOO]？，[M+CH3COO]？。有文獻報道選擇[M+Li]+對紫杉醇類藥物進行測定，相對于[M+H]+峰有更高的質譜響應值，相對于[M+Na]+峰有更穩定的質譜響應值。這是由于Li+是定量加入流動相中的，相對于[M+Na]+來說含量更穩定，而紫杉醇類藥物加和峰往往比[M+H]+峰響應值要大[7，11]。

有些藥物在質譜中容易得到其裂解離子峰，而得不到母離子峰或母離子較小，比如魚腥草素和雄酮。可選擇其確定的脫水裂解峰作為母離子進行定量測定[9，12]。

2 色譜方法

待測藥物色譜方法的選擇通常要根據藥物自身的極性、pKa、結構中的基團等來進行優化。從藥物自身的結構出發，我們在色譜方法建立上，主要考察流動相中有機相-水相比例、pH、緩沖鹽種類和濃度、其他添加物和流動相流速及梯度[7-8，15-17]。

2.1 有機相-水相比例

在用LC-MS/MS法進行血漿藥物濃度測試，通常會讓藥物在3倍死時間之后出峰，避開之前血漿中大極性物質基質干擾[13-14]。待測藥物出峰之后用流速梯度或組分梯度進行沖洗，減少藥物出峰之后的基質干擾。而調節藥物在色譜柱上面的保留，就是靠調節流動相比例來進行的，藥物合適的保留能盡可能減少前后基質的干擾，這樣才能保證相對高且穩定的響應值。

不同的流動相組成也能影響藥物在質譜上的響應值，通常情況下響應值排行：高比例有機相中>純有機相中>高比例水相中>純水相中。此外，有的藥物在一種有機相中響應遠遠小于另一種有機相。通常情況下，正電藥物在甲醇有機相體系中響應大于在乙腈體系中，負電藥物在乙腈體系中響應大于甲醇體系[7，15-16]。

在選擇流動相比例時，要同時考慮質譜響應和色譜分離兩方法因素再做決定。

2.2 流動相pH

不同藥物的pKa不同，故在不同pH流動相中，其分子態-離子態比率不同，最終將影響藥物的離子化狀態，從而對質譜響應值有影響。通常正電藥物在酸性流動相下響應值較高，而負電藥物在堿性流動相下響應值較高。然而流動相pH也會對藥物的色譜行為產生影響，例如正電藥物雖然在酸性流動相下響應值較高，但也容易形成拖尾峰或弱保留[7，15-16]。

此外，還應注意非揮發型酸堿添加劑會對質譜響應造成抑制，不同類型色譜柱對流動相pH的耐受范圍也不同。因此，在選擇流動相pH時應同時考慮多方面因素。

2.3 鹽離子

流動相中適量的鹽離子有助于藥物的電離，相對于不含鹽離子的流動相，藥物的質譜響應值會更大。此外，流動相中鹽離子的存在，可以使流動相體系形成一個緩沖鹽體系，使其在加入酸或堿添加劑時，整個體系的pH相對穩定。提高并且穩定了藥物的離子化效率，從而提高并且穩定了質譜的響應值[15-16]。但鹽離子的濃度并非越高越好，因為濃度過高會抑制質譜響應值，也會在有機相比例增加時析出鹽離子堵塞色譜流路。

和酸堿添加劑一樣，添加的鹽離子必須是揮發型的，因為非揮發性鹽離子（如磷酸鹽）會對質譜造成損害。

2.4 流速

為減少待測藥物出峰前后的干擾和節省分析時間，流速梯度很常用。不同流速進入質譜對響應有明顯影響，ESI源通常接受0.3～0.6 ml/min流速，APCI源通常接受0.5～0.8 ml/min流速。因此，應把待測藥物出峰時間段的流速調至合適流速，而前后沖洗段可用大流速沖洗，并切出離子源流路。此外，在優化質譜響應時，應在確定色譜方法后，再對質譜系統參數進行調整，因為此類參數與流速和比例有較大相關性[8，15-17]。

3 樣品制備方法

目前的血漿樣品處理方法主要有直接蛋白沉淀法、蛋白沉淀上清吹干、液液萃取法和固相萃取法。每種方法各有優缺點，但目的都在于去除血漿中的內源性基質和濃縮樣品等。表1中分別列舉了三種方法的優缺點[18-19]。

對于提高藥物檢測靈敏度來說，濃縮樣品和減少復雜過程中的污染問題，是兩個必須兼顧考慮的問題。此外，最終進入儀器分析的樣品的溶劑組成和pH也是影響質譜靈敏度的重要因素，具體要結合本文的質譜方法和色譜方法中的各方面因素綜合考慮；如果待測物質譜響應非常小，也可通過衍生化法來引入響應基團，增加待測物響應[20-21]。

4 注意事項

因待測藥物濃度很低，故防止樣品污染問題很重要，必須從整個試驗的全過程來防止樣品污染。例如流動相配制過程必須遠離待測藥物，低濃度樣品和高濃度樣品全程隔開，樣品檢測過程Carryover效應必須完全達標，嘗試不同類型的洗針方式和洗針溶液等。這個方面對測試結果準確性有直接影響，但降低本底污染也能相對提高檢測靈敏度。

5 結語

隨著新藥研發的不斷推進，低濃度藥物（如某些藥物活性代謝物毒性更小活性不變或更大）和低檢測靈敏度藥物（部分類固醇類藥物）不斷出現。而血漿藥物濃度的監測，對于藥物安全性有重大意義。因此，提高藥物檢測靈敏度具有重要意義。具體來說，需要從質譜方法、色譜方法和樣品預處理方法三個方面協調改進，以增加檢測靈敏度，為檢測靈敏度較低的血漿中藥物檢測提供幫助，從而為該類藥物的研發助力。

致謝：對中科院上海藥物研究所藥物代謝研究中心的全體領導、同事和學生對此綜述的完稿所提供的幫助表示衷心感謝

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