慢病毒介導的FOXJ1過表達對胃腺癌細胞凋亡及線粒體膜電位的影響

張世甲，李 劍，韓廣森

鄭州大學附屬腫瘤醫院普外科 鄭州 450008

胃癌是一種世界范圍內的惡性腫瘤。胃腺癌是由胃腺體細胞惡性轉化形成，發病機制涉及一系列基因的調控作用，這些基因可以影響細胞的多種生物學特性[1-2]。叉頭框轉錄因子J1(forkhead box J1，FOXJ1)是FOX轉錄因子家族成員，參與纖毛形成、胚胎發育、自身免疫等過程。FOXJ1在不同腫瘤組織中的作用不同，其在肝癌中可能發揮促癌作用，而在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中可能發揮抑癌作用[3-6]。目前的研究[7-8]顯示，FOXJ1在胃癌組織中表達減弱，上調其表達可以降低胃癌細胞轉移潛能。本研究探討了過表達FOXJ1對胃腺癌細胞凋亡的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑FOXJ1過表達慢病毒(Lv-FOXJ1)和陰性對照慢病毒(Lv-NC)由賽業(蘇州)生物科技有限公司構建；胃腺癌細胞SGC-7901購自美國ATCC；Frist Strand cDNA Synthesis購自美國Thermo Fisher公司；SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自大連TaKaRa；引物由金斯瑞生物科技有限公司設計并合成；激活型Caspase-3(C-Caspase-3)抗體、細胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)抗體、激活型Caspase-9(C-Caspase-9)抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；JC-1法線粒體膜電位檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2實驗分組將SGC-7901細胞接種到24孔培養板，37 ℃條件下常規培養過夜，細胞融合度達30%左右開始慢病毒感染。用Opti-MEM稀釋病毒液(MOI=50)，將病毒液添加到細胞中，同時加入Polybrene(終濃度為5 μg/mL)，混合，37 ℃條件下培養24 h，吸棄培養液，加入體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液常規培養72 h，用4 μg/mL嘌呤霉素篩選10 d，收集細胞。穩定感染Lv-FOXJ1和Lv-NC的SGC-7901細胞記為FOXJ1組和陰性對照組，設置不感染慢病毒的SGC-7901細胞為空白對照組。

1.3細胞中FOXJ1mRNA的檢測取各組細胞，添加Trizol(每個6孔板內加入1 mL)，冰上靜置5 min，按照RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA，用First Strand cDNA Synthesis試劑盒合成cDNA，根據SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明進行Real-time PCR。反應條件：95 ℃預變性30 s(1個循環)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40個循環。引物序列：FOXJ1-F為5’-TGGATCACGGACAACTTCTGC TA-3’，FOXJ1-R為5’-CACTTGTTCAGAGACAGGT TGTGG-3’；內參β-actin-F為5’-GAGCTACGAGCT GCCTGACG-3’，β-actin-R為5’-CCTAGAAG CATTTGCGGTGG-3’。用2-ΔΔCt法計算FOXJ1 mRNA表達水平。實驗重復3次。

1.4細胞中FOXJ1蛋白的Westernblot法檢測取各組細胞，添加含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解，用Bradford法檢測蛋白濃度。在蛋白樣品中添加5×上樣緩沖液，98 ℃加熱10 min，4 ℃ 12 000×g離心10 min，-20 ℃保存。配制100 g/L積層膠和8 g/L分離膠，每個泳道上樣50 μg，100 V電壓電泳，直至溴酚藍進入到凝膠底部。用半干法將凝膠上的蛋白轉移到NC膜上(25 mA，轉膜30 min)，將NC膜放在50 g/L脫脂奶粉中室溫封閉2 h，加鼠抗人FOXJ1抗體(1∶600)、鼠抗人β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，加HRP標記的山羊抗鼠二抗(1∶2 000)在室溫孵育1 h，ECL顯色。內參為β-actin。以目的蛋白和內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。實驗重復3次。

1.5細胞存活率的檢測取各組細胞種植到96孔板，每孔5×103個細胞，培養2 d以后取出培養板，每孔加20 μL的MTT培養4 h。吸棄孔內液體，加150 μL的DMSO于搖床上振蕩反應10 min。用酶標儀比色，參比波長為490 nm。設置空白孔調零。實驗重復3次。

1.6克隆形成能力的檢測取各組細胞接種在10 mL的培養皿中，每皿200個細胞，37 ℃培養箱內培養，14 d可觀察到細胞克隆出現。多聚甲醛固定后，吉姆薩染色20 min，室溫條件下干燥，計數細胞數≥50個的克隆數目，以克隆數目與接種細胞數目的百分比表示克隆形成率。實驗重復3次。

1.7細胞凋亡率的檢測取各組細胞，用4 ℃預冷后的PBS洗滌2次，加400 μL結合緩沖液，再加5 μL PI、5 μL Annexin V-FITC，避光條件下孵育20 min，上流式細胞儀檢測凋亡率。實驗重復3次。

1.8胞漿中CytC和細胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白的檢測取各組細胞，提取胞漿中的總蛋白，用Western blot法檢測Cyt C蛋白水平，同時用Western blot方法檢測細胞總蛋白中C-Caspase-3、C-Caspase-9水平；C-Caspase-3、C-Caspase-9抗體均以1∶600稀釋，步驟同1.4。實驗重復3次。

1.9線粒體膜電位的JC-1法檢測取各組細胞配制成單細胞懸液，用PBS重懸3次，加JC-1染色液于37 ℃培養箱中孵育20 min，用冰預冷的JC-1染色緩沖液洗滌2次，添加1 mL的DMEM，上流式細胞儀檢測。正常細胞中JC-1聚集在線粒體中產生紅色熒光，凋亡細胞內JC-1以單體的形式聚集在胞漿中，產生綠色熒光。計算紅色熒光和綠色熒光的比值，以此比值作為線粒體膜電位水平。實驗重復3次。

1.10統計學處理實驗數據用SPSS 21.0分析，3組細胞上述各指標的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組細胞中FOXJ1表達水平的比較FOXJ1組細胞中FOXJ1 mRNA和蛋白表達水平均高于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)。見圖1和表1。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：FOXJ1組

組別nFOXJ1 mRNAFOXJ1蛋白空白對照組31.00±0.080.21±0.02陰性對照組30.98±0.130.20±0.06FOXJ1組31.96±0.23?0.38±0.04?F37.05516.446P<0.0010.004

*：與空白對照組、陰性對照組比較，P<0.05

2.2 3組細胞存活率和克隆形成率的比較FOXJ1組細胞存活率和克隆形成率低于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)。見表2。

表2 3組細胞存活率和克隆形成率的比較

*：與空白對照組、陰性對照組比較，P<0.05

2.3 3組細胞凋亡率和C-Caspase-3、C-Caspase-9表達水平的比較FOXJ1組細胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9表達水平和細胞凋亡率高于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)。見圖2和表3。

2.4 3組細胞線粒體膜電位及胞漿中CytC表達水平的比較FOXJ1組細胞線粒體膜電位低于空白對照組、陰性對照組，胞漿中Cyt C蛋白水平高于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)。見圖3和表4。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：FOXJ1組

組別nC-Caspase-3C-Caspase-9細胞凋亡率/%空白對照組30.13±0.020.19±0.023.99±0.35陰性對照組30.12±0.050.20±0.044.12±0.47FOXJ1組30.35±0.04?0.32±0.03?24.58±3.76?F33.80016.24187.278P<0.0010.004<0.001

*：與空白對照組、陰性對照組比較，P<0.05

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：FOXJ1組

*：與空白對照組、陰性對照組比較，P<0.05

3 討論

FOXJ1基因定位于染色體17q22～q25，屬于FOX轉錄因子家族成員。FOXJ1蛋白由403個氨基酸組成，含有轉錄激活域、核定位序列、DNA結合域。當受到多種細胞因子、生長因子等外界信號刺激時，細胞內的FOXJ1被激活，與靶基因上的KTTT GTTGTTKTW或者HWDTGTTTGTTTA序列結合(其中W表示A或T，H為非G，D為非C，K表示G或者T)，從而影響靶基因的轉錄，目前對于FOXJ1調控轉錄的具體機制尚不明確[9-11]。FOXJ1具有多種功能，參與免疫細胞如T細胞活化等過程，參與細胞內炎癥因子、黏附分子、趨化分子等的表達調控，在脊椎動物纖毛、胚胎發育、神經系統分化等過程中發揮關鍵作用[12-14]。研究[4-5,15]證實FOXJ1參與腫瘤的發生，在不同腫瘤中發揮的作用不同；目前在人類乳腺癌細胞中發現FOXJ1基因異常高甲基化，而在肝癌細胞中FOXJ1表達水平升高。

最近的研究[7-8,16]顯示，FOXJ1在胃癌組織中表達下調，在胃癌發生發展中可能發揮抑癌作用；上調胃癌細胞中FOXJ1的表達后，胃癌細胞的運動、遷移和侵襲能力降低，胃癌細胞分解細胞外基質的能力也下降。本實驗結果表明，過表達FOXJ1的胃腺癌細胞凋亡率升高，同時細胞克隆形成能力和存活能力降低，提示過表達FOXJ1具有抑制胃腺癌細胞生長并誘導凋亡的作用，其在胃癌中發揮抑癌作用。

細胞凋亡是一個主動過程，其發生機制主要有內質網途徑、線粒體途徑、死亡受體途徑等，線粒體途徑是最為經典的細胞凋亡機制。線粒體釋放Cyt C和線粒體外膜通透性增加是線粒體途徑凋亡發生的關鍵。線粒體膜上的通透性轉換孔開放可導致線粒體膜電位下降，存在于線粒體內的Cyt C可進入到胞質中。Cyt C具有激活Caspase-9的作用。Caspase-9是Caspase凋亡反應的上游因子，其活化可以迅速激活Caspase級聯反應，最終激活位于凋亡反應下游的Caspase-3，誘導細胞凋亡發生[17-19]。Caspase-3和Caspase-9在正常細胞中以沒有活性的酶原形式存在，C-Caspase-3、C-Caspase-9分別是Caspase-3和Caspase-9的活化形式，二者是細胞凋亡發生的直接參與因子[20-21]。本實驗結果表明，過表達FOXJ1的胃腺癌細胞線粒體膜電位下降，同時細胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9水平升高，胞漿中Cyt C蛋白水平升高，提示FOXJ1可能通過激活線粒體途徑誘導Caspase凋亡反應，從而促進胃腺癌細胞凋亡。

綜上所述，高表達FOXJ1可以抑制胃腺癌細胞的生長，誘導其凋亡，凋亡誘導機制與線粒體途徑有關。這對于研究FOXJ1在腫瘤發生中的具體機制，對于闡明胃腺癌的發病機制具有重要意義。