HPLC法測定磺丁基醚-β-環糊精中雜質β-環糊精的含量

李聞新，張 余，部 實，張福林

0 引言

磺丁基醚-β-環糊精(Betadex sulfobutyl ether sodium，SBE-β-CD)是20世紀90年代由美國Cydex 公司開發成功的β-環糊精(β-CD)衍生物[1]，能與藥物分子包合形成非共價復合物[2]，提高藥物的溶解度和穩定性。與β-CD相比，SBE-β-CD具有水溶性好、腎毒性低、溶血作用小等優點，已廣泛用于藥物新包合物的研究[3-7]。SBE-β-CD是由1,4-丁烷磺內酯與β-CD發生取代反應得到的，由其合成工藝可知，β-CD是制備原料之一，所以控制SBE-β-CD中β-CD的含量是其質量控制的重要因素。目前僅一項研究報道了SBE-β-CD中β-CD的含量測定方法[8]。該方法采用高效液相色譜-示差折光檢測器，分析時間近30 min。本研究采用蒸發光散射檢測器，并優化色譜條件，將分析時間縮短至10 min內，明顯提高了分析效率，建立了β-CD含量測定方法。該方法靈敏準確、簡便快捷，為SBE-β-CD質控標準的建立奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2420 型蒸發光散射檢測器(沃特世科技有限公司)。

1.2 試藥β-CD對照品(中國藥品生物制品檢定所，純度>98%，批號：100317-201203)，SBE-β-CD供試品 (批次：20131104、20131105、20131106，由我院中心實驗室提供)；甲醇為色譜純(SK chemicals)；水為超純水。

1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(10∶90)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；ELSD參數：漂移管溫度為70 ℃，氣體(N2)壓力為30 psi，進樣量為10 μl。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對照品溶液 精密稱取β-CD對照品23.47 mg，用水溶解，定容到100 ml量瓶中，得濃度為0.234 7 mg/ml的標準溶液。

1.4.2 供試品溶液 精密稱取樣品約385 mg，用水溶解，定容到25 ml量瓶中，得濃度約為15 mg/ml的樣品溶液。

1.5 方法學驗證

1.5.1 專屬性試驗 分別取“1.4”項下的對照品溶液、供試品溶液、二者的混合溶液和空白溶劑，按“1.3”項下色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。

1.5.2 線性和范圍 精密量取對照品溶液適量置10 ml量瓶中，逐級稀釋得濃度為0.078 23、0.117 4、0.156 5、0.195 6、0.234 7 mg/ml的系列溶液，按“1.3”項下色譜條件進樣測定，以峰面積(Y)對β-CD濃度(C)進行線性回歸。

將對照品溶液逐步稀釋并進行測定，以信噪比S/N=10和S/N=3時各對照品的量為定量限和檢測限。

1.5.3 精密度和重復性 于SBE-β-CD溶液中加入適量β-CD對照品，平行制備5份，測定含量，計算RSD，考察方法的精密度。精密吸取β-CD對照品溶液10 μl，重復進樣6次，計算β-CD峰面積的RSD，考察儀器重復性。

1.5.4 穩定性試驗 取β-CD標準品溶液，分別在0、4、8、12 h進行測定，記錄峰面積，計算RSD，考察其穩定性。

1.5.5 回收率試驗 于SBE-β-CD溶液中加入適量β-CD對照品，按供試品溶液的制備方法，平行制備6份，測定β-CD含量并計算回收率。回收率按如下公式計算：(測得量-樣品中含量)/加入量×100%。

1.6 供試品含量測定 取3批SBE-β-CD供試品，按“1.4.2”項下制備供試品溶液，按“1.3”項下色譜條件進樣10 μl，記錄色譜圖和峰面積，以標準曲線法計算供試品的含量。

2 結果

2.1 方法學驗證

2.1.1 專屬性 β-CD和SBE-β-CD的保留時間分別為9.512 min和2.013 min，所用試劑及SBE-β-CD供試品對β-CD的測定均無干擾(見圖1)。

2.1.2 線性和范圍 β-CD在0.078 23～0.234 7 mg/ml的濃度范圍內線性關系良好，線性方程：Y=1.674 7 X+3.593 2，r=0.994 7。β-CD的定量限和檢測限分別為0.078 23、0.045 40 mg/ml。

2.1.3 精密度和重復性 β-CD精密度的RSD為3.4%，表明該方法精密度良好。見表1。重復性試驗結果RSD為4.6%，見表2。

2.1.4 穩定性 β-CD在4個時間點濃度的RSD為2.4%，表明供試品溶液在12 h內基本穩定。見表3。

表1 精密度試驗結果

圖1 專屬性色譜圖

表2 重復性試驗結果

表3 溶液穩定性試驗結果

2.1.5 回收率 β-CD的平均回收率為105.8%，RSD為4.8%，表明該方法的準確度良好。見表4。

表4 回收率測定結果

2.2 含量測定 3批次SBE-β-CD供試品中均未檢測到雜質β-CD。

3 討論

3.1 檢測器的選擇及參數的優化 由于β-CD及其衍生物SBE-β-CD是一類環狀低聚糖，在紫外區域內沒有吸收，所以無法用紫外檢測器進行檢測，只能使用通用型檢測器。有文獻報道，用示差折光檢測器檢測β-CD，也能達到比較高的靈敏度[8]，但該方法分析時間長達30 min，嚴重影響檢測效率。蒸發光散射檢測器(ELSD)作為一種通用型質量檢測器，其針對糖類的檢測已經有不少報道[9-10]，但對β-CD的檢測國內還未見報道，本研究通過優化色譜條件，在提高分析效率的同時取得了較理想的分離效果。

漂移管溫度和載氣壓力是ELSD的2個重要參數[11]，漂移管溫度影響檢測器的響應，溫度升高，流動相蒸發趨于完全，信噪比上升，但溫度過高，可能導致分析物部分氣化，信號強度變小，霧化載氣流速影響霧化器中液滴的形成，從而影響到檢測器的響應，信噪比隨流速的增加而升高，由于本實驗使用的是低溫型ELSD，所以漂移管溫度設為70 ℃即可使流動相完全蒸發，達到理想的分離效果。ELSD的響應取決于被分析物顆粒的數量和大小，在ELSD載氣的壓力對信號的影響很大。載氣壓力太低會形成大量的微粒，從而導致尖峰信號或噪聲信號。當載氣壓力太高時，微粒量會下降，導致信號強度降低，本實驗使用N2作為載氣，最終氣體壓力定為30 psi，此時可達到最小的噪聲信號，色譜圖基線平穩。

3.2 流動相比例的優化 由于相關文獻較少，本研究借鑒了低聚糖的色譜條件[12-13]，并結合專屬性試驗進行了色譜條件的優化。本實驗在40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%范圍內考察不同比例的甲醇水溶液作為流動相的情況，結果顯示，甲醇在流動相中比例增大可有效改善峰形，有利于組分的基線分離，但甲醇比例增加不利于SBE-β-CD和β-CD的溶解，β-CD保留時間也明顯縮短，最終使SBE-β-CD和β-CD分離度降低。當增加流動相中水的比例時，有利于組分的分離，但水的比例過大，不利于流動相在漂移管內的氣化，使基線噪聲增大，從而導致分析靈敏度降低，綜合考慮分離效果、分析時間等因素，選擇甲醇-水(10∶90，v/v)二元混合流動相。

3.3 結論 本研究建立的HPLC-ELSD方法能準確、快速地檢測SBE-β-CD中β-CD的含量，且該方法簡單易行、專屬性強，可用于SBE-β-CD質量控制的研究。