早期使用羥氯喹對系統性紅斑狼瘡模型鼠內皮功能障礙的影響

孫 乾

0 引言

近年來，系統性紅斑狼瘡(SLE)患者的存活率顯著升高。預后改善的原因包括早期診斷，增強對輕度形式的識別，以及謹慎使用諸如糖皮質激素和免疫抑制劑的治療。然而，由于預期壽命延長，SLE患者暴露于與疾病活動后遺癥藥物不良反應和共病癥狀[如心血管疾病(CV)早發率]相關的發病風險增加[1-2]。加速動脈粥樣硬化是SLE患者CV發病和死亡的主要原因之一。近30年來，除心血管疾病外，SLE患者所有原因的死亡率都顯著降低。由于上述原因，預防SLE患者長期CV并發癥仍然是一個尚未解決的問題。除了伴隨傳統的CV風險因素，包括肥胖、高血壓、血脂異常和糖尿病，SLE本身對血管系統會產生直接有害的影響，這使得SLE本身成為一種有效的獨立CV風險因子[3-4]。內皮功能障礙(ED)的特征在于一氧化氮(NO)的可用性受損以及伴隨的活性氧(ROS)生成增加[5]。這種全身性疾病是大多數心血管危險因素所共有的，是動脈粥樣硬化和血栓形成的早期和主要促進因子，并且與CV事件獨立相關[5]。SLE和動脈粥樣硬化共享血管炎癥，ROS過量、免疫復合物和補體激活等機制都能引發ED。羥氯喹(HCQ)是一種具有免疫調節特性的抗瘧疾化合物，由于其多種有益作用，包括控制疾病活動、減少損傷、提高生存率和相對安全的特征，廣泛用于SLE[6-10]。近年研究顯示，HCQ治療與SLE中CV預后的改善有關。SLE對傳統CV風險因素和血栓形成風險有促進作用;此外，其還對血管反應性指數有益[11-12]。然而，目前尚不清楚抗瘧藥的保護性CV效應是否是更好地控制疾病活動的間接結果，或者是HCQ對內皮微環境的直接影響。狼瘡鼠模型的可用性提供了良好的條件，可以在“簡化”環境中研究這種關系，以提高對多種因素作用的理解。Gómez-Guzmán等[13]研究表明，在疾病晚期開始的HCQ短期治療能夠在小鼠SLE模型的大動脈水平上逆轉ED。除了抗瘧疾在成熟疾病條件下的有益作用外，早期HCQ的使用也與人類SLE發作延遲有關。我們假設在完全疾病發作之前用HCQ治療可能會延遲甚至預防SLE相關的ED。本研究旨在評估HCQ對SLE小鼠模型內皮功能的影響及其潛在機制。

1 資料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 普通級健康雌性大鼠120只，體重(148±20)g,由遼寧中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.1.2 實驗藥品及制備 羥氯喹片(上海中西制藥有限公司，批號：170406)。

1.1.3 主要試劑 降植烷試劑：購自上海如吉生物科技發展有限公司,批號：049k8700；免疫吸附測定試劑盒：美國德克薩斯州圣安東尼奧公司。乙酰膽堿濃度測定試劑盒：美國Sigma-Aldrich公司。NAD(P)H氧化酶抑制劑,APO(瑞士圣加倫大學)。

1.1.4 主要儀器及設備 電子天平：瑞士preci-sa，型號：xs-225A；低速臺式離心機：北京醫用離心機廠，型號：LD4-ZA；Axio Imager Z1顯微鏡(Carl Zeiss MicroImaging,Jena,德國)；加壓肌動圖(110P型，丹麥)。以上均由遼寧中醫藥大學分子生物實驗室提供。

1.1.5 實驗室 整個實驗室均安排在遼寧中醫藥大學清潔級實驗室中實施。本課題涉及實驗室-分子生物學實驗室系國家中醫藥管理局局級科研三級實驗室(2002年批準)。

1.2 實驗方法與結果

1.2.1 實驗動物分組 選擇雌性健康大鼠120只，體重(148±20)g，鼠齡4周。隨機選大鼠40只為對照組，另外80只建立降植烷誘導的SLE模型。后者隨機分為模型組和羥氯喹組，40只為一組。

1.2.2 模型制備 隨機取40只為對照組，另外80只建立降植烷誘導的SLE模型。一次性腹腔注射降植烷0.5 ml。

1.2.3 處理因素 ①模型組:造模后4周開始給予生理鹽水[2 ml/(只·d)]灌胃。②羥氯喹組:隨機分配到飲用水中接受HCQ[3 mg/(kg·d)]治療。③對照組:不做任何處理。

1.2.4 取材 以上各組雌性鼠在周齡為12、18、24、30周時，隨機取10只在阿維汀誘導的麻醉下死亡。血清和尿化驗:在小鼠被殺時采集血樣并立即放入肝素管中。在殺死小鼠時，收集血樣并立即置于肝素化管中。通過離心分離血清并儲存在-70 ℃。小腸系膜動脈的制備:將腸系膜動脈樹的一個二階分支解剖并安裝在加壓肌電圖上，在45 mmHg內壓力下測量介質和腔的尺寸。

1.2.5 指標檢測 血清和尿化驗:用酶聯免疫吸附測定試劑盒分析抗dsDNA自身抗體的血清滴度，在代謝籠中收集24 h尿蛋白排泄物，并通過試紙分析測量。小腸系膜動脈功能試驗：血管內皮依賴性舒張因子(NO)的評估是通過測量腸系膜動脈乙酰膽堿緩慢的反應累積濃度來進行。該濃度在劑量滴定實驗中確定，建立閾值濃度，可引起實驗組間類似的收縮。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件，數據比較采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 24 h尿蛋白含量測定 模型組24 h尿蛋白含量明顯增多(P<0.05)。24周及30周羥氯喹組較模型組24 h尿蛋白定量明顯下降(P<0.01)，與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白含量比較(mg)

2.2 酶聯免疫吸附測定試劑盒分析抗dsDNA自身抗體的血清滴度 降植烷造模4周后，對周齡12、18、24、30周的模型組、羥氯喹組、對照組大鼠dsDNA自身抗體的血清滴度(酶聯免疫吸附法測定)進行比較，結果使用微量滴定板讀數器測量的光密度(OD)(血清在450 nm處的OD讀數的平均值)表示，24周時模型組dsDNA血清滴度明顯高于羥氯喹組(P=0.02)。見圖1。

2.3 NO可用性評估 通過測量腸系膜動脈乙酰膽堿(ACh)緩慢的反應累積濃度間接測量NO的可用性。對照組響應于ACh的放松保持到24周，但是在30周減弱。模型組ACh響應松弛，在基線時保留，但在18、24、30周時顯著低于對照組(P<0.05或P<0.01)。羥氯喹組18、24周時ACh響應的松弛正常化。30周時，HCQ對于動物的內皮功能的調節無效(P>0.05)。見圖2。

圖1 各組大鼠dsDNA自身抗體血清滴度比較

圖2 各組大鼠腸系膜動脈NO可用性評估

3 討論

本研究結果表明，HCQ早期施用能夠在SLE的小鼠模型中阻止ED的發展。先前已在小鼠以及人SLE中描述了內皮功能損傷[14]。本研究的小鼠模型中，ED在疾病的非常早期階段。在18周齡時，模型組腸系膜小動脈已顯示出內皮依賴性舒張減弱，并且在此階段抗dsDNA抗體呈陽性。為了排除這些影響可能是由衰老本身引起的(這是一個公認的血管功能改變的主要原因)，每次疾病測量結果都與年齡相關的對照組進行比較，在30周齡時，對照組NO的可用性降低，但模型組降低更明顯。表明無論疾病活動和衰老情況如何，SLE相關ED均是在疾病過程早期發生的功能性血管改變，完全支持SLE患者的觀察結果。這些患者可能經歷過早期動脈粥樣硬化,而與CV疾病的傳統危險因素無關。

眾所周知，腎臟受累本身可引起ED。因此，觀察到HCQ對內皮功能的有益作用可能是腎病改善的結果。然而，在我們的實驗模型中，考慮到HCQ誘導的ED逆轉發生在明顯的腎臟疾病之前，該假設不太可能成立。此外，即使長期施用HCQ對蛋白尿和抗dsDNA自身抗體具有積極作用，其保護性血管作用也不僅與腎臟疾病有關，還與藥物干擾血管炎癥過程的能力以及導致ED的免疫機制有關[15-17]。

有研究表明，同一模型中，36周齡時主動脈的內皮依賴性血管舒張受損明顯，與疾病的表現一致。而本研究結果表明，在完全疾病表達之前也顯示出早期血管內皮細胞的功能受損。Gómez-Guzmán等[13]在相同的SLE模型中，描述了短期HCQ對血管參數(高血壓、心率、心臟肥大以及與疾病相關的變量)的保護作用。與本研究類似，該研究發現，即使在諸如主動脈的大血管床中，HCQ對血管內皮依賴性血管舒張仍有有益作用。

綜上所述，早期HCQ治療能夠減少SLE鼠模型中與炎癥過程相關的早期ED。這些數據可能支持臨床觀察HCQ在預防人類SLE血管損傷方面的潛在有益作用,并可能支持早期疾病發作患者早期引入HCQ。