CCR3特異性拮抗劑GW766994在阿爾茨海默病發(fā)病機制中的作用研究

隋 軼，徐 冰，任 莉，董春瑤，張 堯

0 引言

阿爾茨海默病(AD)是目前老年人癡呆的主要原因之一，其主要病理標志包括由星形膠質細胞和微膠質細胞包圍的細胞外淀粉樣蛋白β(Aβ)沉積共同構成的老年斑；小膠質細胞、神經元纖維纏結的細胞內積累(由過度磷酸化的tau組成)，以及神經元和突觸的喪失[1-2]。絕大多數(shù)AD病例發(fā)病晚，通過治療或預防能明顯延遲發(fā)病年齡[3]。越來越多的證據(jù)表明，由活化的星形膠質細胞和小膠質細胞產生的促炎性細胞因子、趨化因子和神經毒素在AD的發(fā)病機制中起著重要作用[4]。由于它們在調節(jié)神經元-小膠質細胞交互影響中的關鍵作用，趨化因子在AD研究中引起了越來越多的關注[5]。因此，探討趨化因子在AD病理學中的作用，有助于對AD發(fā)病機制的理解及開發(fā)新的AD治療方法。

CCL11可能是參與AD病理學的一種重要趨化因子。在衰老過程中，CCL11在血清中逐漸升高，其年齡依賴性增加與海馬依賴性學習和記憶任務的缺陷相關[6]。因此，CCL11很可能是影響海馬功能的關鍵因素，并與AD有密切關聯(lián)。相關機制可能是CCL11與一種由星形膠質細胞、小膠質細胞和神經元表達的趨化因子受體CCR3相結合[7-10]。本研究觀察特異性CCR3拮抗劑GW766994是否通過拮抗趨化因子CCL11的作用影響AD的病理變化。

1 資料和方法

1.1 體視學細胞計數(shù)分析 應用熒光或光學顯微鏡進行體視學分析，油浸100×物鏡。使用無偏立體細胞計數(shù)技術的光學分離器方法計數(shù)海馬中Aβ斑和p-Tau陽性神經元的數(shù)量[11-12]。

1.2 蛋白質印跡分析[11]將細胞或腦組織在含有蛋白酶抑制劑混合物的TBS(20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，pH=7.4,150 mmol/L NaCl)中勻漿，包括0.5 mmol/L苯甲基磺酰氟，20 μg/ml 抑肽酶，20 μg/ml亮抑酶肽，20 μg/ml 胃蛋白酶抑制劑和1 ml EDTA(所有從Sigma獲得的抑制劑)。將勻漿物短暫超聲處理并以15 000×g離心30 min。在還原條件下，將樣品(每泳道10 μg 蛋白質)在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(GE Healthcare)膜上。用含有0.1%Tween 20、3%干乳的TBS封閉膜1 h，然后在室溫下用特異性抗體孵育2 h。洗滌后，將印跡與相應的HRP標記的第二抗體(1∶1 000稀釋)一起溫育1 h。使用ECL系統(tǒng)(GE Healthcare)檢測標記。使用光密度測定軟件(Scion Image)分析條帶。后續(xù)抗體用于蛋白質印跡：兔多克隆抗APPC末端片段(CTF)(Sigma)，小鼠單克隆抗p-tau(T181)(1∶500;Abcam)，兔多克隆抗p-tau(T205)(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，兔多克隆抗p-tau(Ser199)(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，兔多克隆抗p-tau(Ser235)(1∶1 000;Santa Cruz)Biotechnology)，小鼠單克隆抗細胞周期蛋白依賴性激酶5(CDK5)(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，小鼠單克隆抗p-ERK1/2(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，小鼠單克隆抗p-CDK5(Ser159)(1∶200;Santa Cruz Biotechnology)，小鼠單克隆抗p-糖原合成酶激酶3β(GSK3β)(Ser9)(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，小鼠單克隆抗磷酸化GSK3α/β(Tyr279/216)(1∶1 000;ECM Biosciences)，兔多克隆抗tau(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，小鼠單克隆抗GSK3β(1∶4 000;Sigma)，小鼠單克隆抗ERK2(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，小鼠單克隆抗β-actin(1∶4 000;Sigma)。GW766994為同濟大學范國煌教授饋贈。

1.3 樹突棘的數(shù)量測定 利用Matlab 軟件分析樹突長度和這些神經元中蘑菇刺的數(shù)量。

1.4 原代神經元培養(yǎng)和轉染[13]在胚胎第18～19天,從大鼠胎兒制備。在手術顯微鏡下解剖胚胎大鼠海馬組織，并用0.15%胰蛋白酶在37 ℃消化10～15 min。通過添加10%補充的DMEM結束消化胎牛血清。用70 μm細胞過濾器過濾海馬神經元懸浮液，然后在有或沒有聚-D-賴氨酸氫溴酸鹽包被的蓋玻片的培養(yǎng)板中鋪板。將細胞維持在補充有10%FBS和1%Pen/Strep的DMEM中。接種后12 h，用含有2% B27補充物、1% Glutamax和1%Pen/Strep的Neurobasal培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。對于形態(tài)學研究，使用Lipofectamine 2000在體外培養(yǎng)7 d瞬時轉染EGFP載體的神經元培養(yǎng)物。在蓋玻片上生長的神經元(14 DIV)用PBS洗滌，并在室溫下在4%甲醛(pH 7.4)中固定15 min。然后用SlowFade Light試劑(Molecular Probes，Eugene，OR)安裝在載玻片上。

1.5 原代海馬神經元培養(yǎng)物中Aβ水平的ELISA分析 使用高度敏感夾心ELISA試劑盒(Immuno-Biological Laboratories，Gunma，Japan)測量原代細胞培養(yǎng)基中Aβ的濃度。簡言之，單克隆兔抗人IgG抗Aβ35-40或抗Aβ38-42分別用于標記Aβ1-40和Aβ1-42。辣根過氧化物酶綴合的抗人Aβ11-28Fab用于以上2種測定中的檢測[14]。該檢測抗體識別Aβ1-40的整合和N-末端切割的變體和Aβ1-42。Aβ1-40和Aβ1-42的測量范圍分別為4～231 pmol/L和3～178 pmol/L。

1.6 免疫細胞化學和共聚焦顯微鏡[15]將細胞用含有4%多聚甲醛的PBS(pH 7.4)固定15 min，然后用PBS中的0.5% Triton X-100膜透化5 min。在37 ℃下用3%牛血清白蛋白封閉1 h后，將細胞與以下一抗孵育：兔多克隆抗MAP2抗體(1∶200，Sigma)和小鼠單克隆抗CCR3抗體(1∶200，Santa Cruz)，4 ℃過夜。然后將細胞與綴合至花青3(Cy3，1∶500;Jackson ImmunoResearch)或Alexa 488(1∶500;Molecular Probes)的二抗一起溫育。使用具有25×或63×水浸物鏡 LSM 510 Zeiss顯微鏡獲得熒光圖像。所有圖像均以512×512像素分辨率拍攝。

2 結果

2.1 CCR3在14 DIV海馬神經元中的表達 用抗CCR3和抗MAP2抗體共同免疫染色海馬神經元培養(yǎng)物(14 DIV)，發(fā)現(xiàn)CCR3和MAP2表達神經元之間的共定位(圖1A)，而用同種型對照IgG的免疫染色未顯示CCR3信號(圖1B)，表明CCR3在神經元中的特異性表達。通過計數(shù)每組200個神經元，觀察到100%神經元表達CCR3。

圖1 CCR3在14 DIV海馬神經元中的表達

注：免疫熒光顯示海馬神經元培養(yǎng)物中MAP2的CCR3的共定位(14 DIV)。Scale bar=50 μm

2.2 CCL11處理導致CDK5的激活 CCL11在治療野生鼠(非CCR3- / -小鼠)的海馬神經元時(圖2)，可導致CDK5的激活，CDK5是一種蛋白激酶，在AD發(fā)病機制中起重要作用[16]。

圖2 CCL11處理導致CDK5的激活

注：來自野生型或CCR3- / -小鼠的海馬神經元培養(yǎng)物(14 DIV)的細胞裂解物中，在CCL11(10 nmol/L)不存在或存在條件下共培養(yǎng)30 min，磷酸化CDK5(Ser159)和CDK5的蛋白質印跡試驗結果

此外，CCL11誘導的CDK5活化被CCR3特異性拮抗劑GW766994(10 μmol/L)，以劑量依賴的方式所逆轉(圖3)。

圖3CCL11誘導的CDK5活化被CCR3特異性拮抗劑劑量依賴性逆轉

注：A.在存在或不存在不同濃度GW766994的情況下，給予或不給予CCL11(10 nmol/L)處理的30 min海馬神經元培養(yǎng)物(14 DIV)細胞裂解物中磷酸化CDK5(Ser159)和CDK5的蛋白質印跡試驗結果。B.磷酸化CDK5的定量分析。數(shù)據(jù)表示為未處理樣本值的倍數(shù)。通過單向ANOVA分析，與未處理組相比,*P≤0.05，**P≤0.01

2.3 CCL11處理導致CDK5和GSK 3β磷酸化的時間依賴性增加，從而介導Tau蛋白磷酸化增加 處理海馬神經元培養(yǎng)物(14 DIV)與CCL11(10 nmol/L)不同的時間間隔后，導致CDK5和GSK3β磷酸化時間依賴性增加，后者在AD發(fā)病機制中也起著重要的作用[16]。CDK5和GSK3β磷酸化可以通過GW766994(10 μmol/L)(一個CCR3特異性拮抗劑)預處理而逆轉，表明這些信號傳導途徑是通過CCR3介導的(圖4)。

主要通過CDK5和GSK3β介導的Tau蛋白磷酸化是AD的主要標志,用CCL11(10 nmol/L)處理海馬神經元(14 DIV)15 min，導致在幾個測試位點(包括T181、T205、S235、S199)的tau磷酸化增加，并且這種變化可被GW766994(10 μmol/L)所逆轉(圖5、圖6)。

2.4 CCL11處理導致神經元中Aβ產生的時間依賴性增加 從體外第14天開始，用對照或不同濃度的CCL11處理原代海馬神經元細胞48 h，CCL11處理的細胞中觀察到顯著的時間依賴性Aβ1-42分泌增加，此變化同樣可被GW766994(10 μmol/L)所逆轉。針對CCL11的處理，Aβ 1-40水平也出現(xiàn)了增加，但這種影響并沒有達到統(tǒng)計學意義(圖6B)。為了補償培養(yǎng)基的任何不均勻蒸發(fā)，對培養(yǎng)基樣品進行Bradford蛋白質測定，數(shù)據(jù)以pmol Aβ/100μg蛋白質表示(圖6)。

圖4 CCL11處理導致CDK5和GSK3β磷酸化的時間依賴性

注：A.在海馬神經元培養(yǎng)物(體外14 d)的細胞裂解物中給予CCL11(10 nmol/L)處理，同時加用或不加用GW766994(10 μmol/L)，不同時間間隔條件下的磷酸化CDK5(Ser159)、CDK5、磷酸化GSK3α/β(Tyr216)和GSK3β結果。B.磷酸化的CDK5、GSK3β的定量分析結果，結果分別表示為未經處理的細胞值的倍數(shù)。數(shù)據(jù)來自3個獨立實驗。通過單向ANOVA分析差異。與同一治療組的零時間點比較，*P<0.05，**P<0.01；與用載體處理的細胞相比，#P<0.05，##P<0.01

2.5 CCL11處理導致神經元形態(tài)改變 表達EGFP的海馬神經元(14 DIV)在有/無GW766994(10 μmol/L)的條件下用/不用CCL11(10 nmol/L)處理，對樹突狀復雜性和樹突棘密度進行評估。結果顯示，CCL11處理導致樹突狀交叉(圖7)數(shù)量及樹突棘(圖7)密度顯著減少，此變化可以被GW766994(圖1)的預處理所逆轉。

3 討論

衰老期間趨化因子在血清中水平升高，目前，其在神經變性疾病中的作用正在引起越來越多的關注。在本研究中，我們證明了誘導CCL11介導了海馬神經元培養(yǎng)物中CDK5和GSK3β的活化，與升高的tau磷酸化相關聯(lián)，增強Aβ的產生，并加速樹突棘的缺失。

圖5用CCL11(10nmol/L)處理海馬神經元測試位點的tau磷酸化及逆轉

注：A.海馬神經元裂解物經過CCL11(10 nmol/L)處理10 min，加用和不加用GW766994(10 μmol/L)的培養(yǎng)物中，磷酸化tau在T181、T205、Ser235、Ser396位點的結果。B.不同磷酸化位點tau磷酸化的定量分析。量化數(shù)據(jù)表示為未處理樣本值(時間零)的倍數(shù)。通過單向ANOVA分析差異。與同一治療組的零時間點比較,*P<0.05，**P<0.01；與用載體處理的細胞相比,#P<0.05，##P<0.01

圖6用CCL11(10nmol/L)處理海馬神經元測試位點的tau磷酸化及逆轉

注：A.在原代海馬神經元培養(yǎng)物中CCL11對可溶性Aβ1-42的影響。Aβ水平通過ELISA方法，在經過載體或CCL11處理的細胞培養(yǎng)基中加入或者不加入GW766994的樣本中測定。數(shù)據(jù)來自3個獨立的實驗，通過單向ANOVA分析差異。與未經任何處理的細胞相比，**P<0.01。與經過載體溶液和CCL11處理的細胞相比，##P<0.01。B.在原代海馬神經元培養(yǎng)物中CCL11對可溶性Aβ1-40的影響。方法同上。盡管存在趨勢，但CCL11處理對Aβ1-40沒有觀察到顯著影響(P=0.077)

圖7 CCL11處理導致神經元形態(tài)改變

在AD患者的大腦中，tau異常過度磷酸化，并且在這種改變的狀態(tài)下，聚集成成對的螺旋狀細絲，形成神經元纖維纏結。據(jù)推測，不同部位的tau蛋白過度磷酸化對其生物學功能及其致病作用有不同的影響。在Ser262、Thr231和Ser23位點的 tau過度磷酸化抑制其與微管的結合[17]，在Ser199/Ser202/Thr205、Thr212、Thr231/Ser235、Ser262/Ser356和Ser422位點的超磷酸化，使tau轉換成為一種抑制正常微管相關蛋白的抑制分子[18]。此外，新皮質中神經纖維纏結的密度與癡呆相關[19]。因此，開發(fā)合理的基于tau的治療藥物需要識別tau異常過度磷酸化的觸發(fā)因素并理解其內在機制。趨化因子可能是涉及tau蛋白病理的重要因素。例如，CXCL1 通過CXCR2(CXCL1 受體)介導的ERK1/2激活觸發(fā)原代神經元培養(yǎng)物中的tau 蛋白過度磷酸化。最近的一項研究進一步表明，用CXCL1處理長期神經細胞培養(yǎng)物導致tau以caspase-3依賴性方式切割。在本研究中，發(fā)現(xiàn)CCL11/CCR3在tau蛋白過度磷酸化中發(fā)揮作用。基于觀察到納摩爾濃度的CCL11直接誘導原代神經元培養(yǎng)物中的tau磷酸化，我們認為CCL11的年齡依賴性增加是AD的潛在危險因素。

除了tau蛋白病理外，AD的另一個重要病理標志是通過β-和γ-分泌酶裂解APP所產生的Aβ肽，聚集并在腦中形成的Aβ沉積物。γ-分泌酶將APP C-末端片段切割成2種主要形式的Aβ多肽Aβ40和Aβ42。Aβ42的相對量對于AD進展特別關鍵，其比Aβ40肽更容易聚集[20-22]。然而，在散發(fā)AD人群中，APP處理和Aβ產生的觸發(fā)因素仍然很不明確。本研究結果表明，CCL11在原代神經元培養(yǎng)物中以CCR3依賴的方式誘導了顯著的Aβ42增加和中等程度的Aβ40增加。

本研究結果表明，CCL11/CCR3在 Aβ產生，tau蛋白過度磷酸化和在突觸丟失中起作用，同時CCL11誘導的蛋白激酶尤其CDK5和GSK3β的活化，也促進了上述有害作用的發(fā)生。GW766994作為一種特異性CCR3拮抗劑，顯著逆轉了上述過程，為AD治療提供了可能的靶點。我們推測CCL11的這種增加是Aβ在大腦中產生的一個危險因素，并且早期干擾CCL11/CCR3通路可能延遲AD的發(fā)生。

在本研究中，我們證明CCL11培養(yǎng)導致了CDK5和GSK3β的顯著活化。結果顯示，CCL11增強了tau磷酸化和Aβ的產生，并與海馬神經元培養(yǎng)物中的樹突棘損失有關。CCR3的特異性拮抗劑GW766994逆轉了上述全部過程。因此，拮抗CCR3介導的tau蛋白過度磷酸化，Aβ產生和突觸損失可能會給AD帶來治療效果。