不同利福平血藥濃度對肺結核患者免疫功能的影響

李明瑛，牛文一，姚恒波，席秀娥，王 霞

0 引言

肺結核是臨床常見的肺部慢性傳染性疾病，流行病學調查顯示，近年來，其發病率及死亡率均呈升高趨勢。肺結核多因結核分枝桿菌感染引起，飛沫傳播為主要傳播途徑，常累及肺臟，多發生在成人，病程長，易復發[1]。世界衛生組織在阻止結核策略中提出了該病標準化療方案，復治涂陽肺結核者每日化療方案為3HRZE/6HRE，即強化期3個月異煙肼(Isoniazid，INH，簡稱H)、利福平(Rifampin，RFP，簡稱R)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA，簡稱Z)、乙胺丁醇(Ethambutol，EMB，簡稱E)四藥聯用，鞏固期6個月H、R、E三藥聯用，能取得較為滿意的臨床效果[2]。其中，利福平作為開發較早的利福霉素類半合成廣譜抗菌藥，較異煙肼、鏈霉素而言，其殺滅結核菌活性更強，具有高效、半衰期延長、抗耐藥等特點，療效確切，目前已成為抗結核的主要藥物[3]。然而，有報道，由于患者藥物代謝率不同，導致不同患者應用同等劑量藥物后療效與不良反應差異明顯；其中，利福平個體血藥濃度差異若較大，治療效果則不盡相同[4]。因此，本文主要探究不同利福平血藥濃度對肺結核患者免疫功能的影響，旨在為復治涂陽肺結核免疫治療提供參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用隨機平行對照方法納入2014年5月至2017年5月于我院收治的接受3HRZE/6HRE常規化療方案治療的86例肺結核患者為研究對象，開展前瞻性研究。抽取患者清晨靜脈血2 ml，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測利福平血藥濃度，結果為5.55～11.26 mg/L，中位值9 mg/L，按照所有患者利福平血藥濃度中位值高低將其分為2組，其中觀察組54例，利福平血藥濃度9～11.26 mg/L；對照組32例，利福平血藥濃度5.55～8.99 mg/L。本研究獲我院醫學倫理委員會批準，兩組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

1.2 納入標準 ①符合《肺結核診斷和治療指南》[5]中相關診斷標準，伴有發熱、胸痛、咳嗽等癥狀，涂片或培養、痰液檢查見(或未見)抗酸桿菌，X線檢查提示存在肺部病灶；肺部病理組織檢查提示存在典型結核小結；②抗結核治療前肝功能正常；③近2年內未接受免疫抑制劑治療；④年齡≥18歲，復治涂陽肺結核者，即初治失敗、規則用藥滿療程后痰菌復陽、慢性排菌或不規則化療>1個月的肺結核患者；⑤患者對本研究知情且簽署同意書。

1.3 排除標準 ①合并病毒性肝炎、自身免疫型肝炎、酒精性肝病、低氧血癥、充血性心力衰竭、菌血癥等可引起肝功能異常的疾病；②伴糖尿病、艾滋病、長期應用激素等；③合并精神病及癲癇病史者；④過敏體質或對本研究藥物過敏者；⑤妊娠期或哺乳期婦女。

1.4 方法

1.4.1 治療方法 行3HRZE/6HRE治療。強化期，維持3個月。異煙肼(沈陽紅旗制藥有限公司，國藥準字H21022350，規格0.1 g/片)0.3 g/次，qd；利福平(廣東華南藥業集團有限公司，國藥準字H44020771，規格0.15 g/片)0.45 g/次，qd；吡嗪酰胺(成都錦華藥業有限責任公司，國藥準字H51020877，規格0.25 g/片)1.5 g/次，qd；乙胺丁醇(杭州民生藥業有限公司，國藥準字H33021602，規格0.25 g/片)0.75 g/次，qd。鞏固期，維持6個月。異煙肼0.3 g/次，qd；利福平0.45 g/次，qd；乙胺丁醇0.75 g/次，qd。

1.4.2 利福平血藥濃度檢測方法 所有患者每日按時按量口服抗結核藥物，于第7天清晨空腹服藥后2 h采集肘靜脈血2 ml，置入乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetracetic acid，EDTA)抗凝管，于低溫高速離心機(德國Eppendorf)內以3 000 r/min速度離心10 min，吸出上清液后裝入1.5 ml凍存管內，置于液氮罐儲存。采用Agilent 1260型高效液相色譜(美國Agilent)，以Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，以甲醇∶水(70∶30)為流動相，流速為1 ml/min，檢測波長為340 nm，測定利福平血藥濃度。利福平標準品購自大連美侖生物技術有限公司。

表1 兩組患者一般資料比較(例,%)

1.4.3 免疫細胞檢測方法 在治療前后采集患者外周靜脈血5 ml，留取乙二胺四乙酸抗凝血標本，血漿離心后置入-80 ℃冰箱冷凍保存。采用FACSCalibur型流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)，測定機體免疫細胞CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比及調節性T細胞(Regulatory cells，Treg)、骨髓來源抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)水平。異硫氰酸酯熒光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的抗CD3抗體、藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)標記的CD4抗體及MDSC標記抗體PE-CD11b、FITC-CD33、APC-HLA-DR，均由Beckman Coulter公司生產。Treg細胞標測試劑盒購于美國Thermo scientific公司。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 血清炎性因子檢測方法 使用UniCel DxI 800全自動化學發光免疫分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)，以雙抗體放免分析法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平，以酶聯免疫吸附實驗(ELISA)測定血清C-反應蛋白(CRP)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)水平，試劑盒均購自上海碧云天生物有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.5 細菌學檢測方法 于治療前留取患者痰涂片3次，每次結果呈陽性。治療過程中每月復留取痰涂片，直至治療結束。痰菌轉陰率判斷：參考《中國結核病分類法》[6]，連續2個月痰菌培養為轉陰未復陽者。

1.5 觀察指標 觀察兩組血清炎性因子TNF-α、CRP、IL-6、IL-10水平，對比免疫功能指標CD4+、CD8+、Treg、MDSCs百分比及CD4+/CD8+比值，并分析強化期結束時、治療結束時及結束后1個月痰菌轉陰率。比較兩組不良反應發生率。

2 結果

2.1 兩組血清炎性因子水平比較 觀察組治療后TNF-α、CRP、IL-6、IL-10水平均顯著低于治療前及對照組治療后(P<0.05)，見表2。

2.2 兩組免疫功能指標比較 觀察組治療后CD4+、CD4+/CD8+水平顯著高于治療前及對照組治療后(P<0.05)，Treg細胞、MDSCs水平顯著低于治療前及對照組治療后(P<0.05)，CD8+水平與治療前及對照組治療后比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.3 兩組痰菌轉陰率比較 觀察組強化期結束時、治療結束時及結束后1個月痰菌轉陰率均顯著高于對照組(P<0.05)，見表4。

表2 兩組血清炎性因子水平比較

注：與治療前比較，*P<0.05;與對照組比較，#P<0.05

表3 兩組免疫功能指標比較

注：與治療前比較，*P<0.05;與對照組比較，#P<0.05

表4 兩組痰菌轉陰率比較(例，%)

2.4 兩組不良反應觀察 兩組未見嚴重不良反應發生，肝腎功能檢查無異常，觀察組1例輕度惡心、嘔吐，可耐受，未經干預后自行緩解。兩組不良反應發生率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

有報道，復治涂陽肺結核患者免疫功能紊亂是引起其復發及細菌擴散的關鍵原因[7]。目前，復治涂陽肺結核患者多采用3HRZE/6HRE方案治療，其中利福平作為一線抗結核病首選藥物之一，靜脈注射0.5 h后血藥濃度可達最高峰，藥物廣泛分布于全身，直接參與血液循環，具有廣譜殺菌功效，能有效抑制宿主細胞中細菌大量繁殖[8]。但由于個體間血藥濃度差異較大，尤其合并肝臟損傷的結核病患者更為明顯，既往經驗劑量已難反映其臨床療效[9]。對此，筆者主要立足于利福平血藥濃度角度，探究其與肺結核患者免疫系統缺陷的相關性，旨在指導臨床治療。

本研究結果顯示，觀察組治療后TNF-α、CRP、IL-6、IL-10水平均明顯低于治療前及對照組治療后，證實利福平血藥濃度升高可有效降低復治涂陽肺結核患者機體炎癥因子水平。研究表明，活動性肺結核患者在抗結核治療中，其血清促炎因子(如IL-6、IFN-γ等)呈現動態變化，與患者病情發展、預后轉歸存在直接關系[10]。具體而言，TNF-α為多功能炎性細胞因子，能有效激活IL-6等炎性因子釋放，促進內皮素生成；CRP屬于非特異性炎性標志物，當心肌細胞缺血缺氧性損傷出現時其濃度會持續升高，在誘發血管炎癥、促進血栓形成中具有重要作用；IL-6為促進炎癥反應類因子，多由成纖維細胞、巨噬細胞、T細胞等產生，能誘導CRP生成，引起血小板聚集，促使炎癥細胞聚集、黏附及新生內膜生成，加快機體對炎癥反應速度；IL-10為抑制炎癥反應類細胞因子，能誘導CD4+T細胞及CD8+T細胞活性下降，抑制細胞介導的相關免疫應答[11]。有報道，伴隨著肺結核病灶范圍的逐漸增大，空洞出現，患者機體免疫功能明顯下降，易遭受結核分枝桿菌侵襲，引起肺組織破壞，出現肺部炎癥反應，導致炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-10等大量分泌[12]。利福平屬于利福霉素類抗結核藥，脂溶性較好，能達到較高的組織血漿濃度比值，血藥濃度升高，可更好地調節促炎及抗炎細胞因子水平，抑制炎癥滲出，減少炎癥介質釋放，改善炎癥遞質及患者血液動力學，減輕組織病理損傷，起到免疫抗感染作用[13]。

本研究結果顯示，觀察組治療后CD4+、CD4+/CD8+水平明顯高于治療前及對照組治療后，且Treg細胞、MDSCs水平明顯低于治療前及對照組治療后，證實利福平血藥濃度升高可有效改善復治涂陽肺結核患者免疫功能。有報道，T淋巴細胞介導的免疫應答反應與肺結核病情進展、恢復存在一定關聯，很大程度上免疫損傷會促使受抑結核分枝桿菌再次活躍，并重新侵入機體進行繁殖，致使病灶惡化進而發病[14]。而謝永國等[15]通過監測老年患者體內利福平濃度水平并對其藥代動力學特征進行研究，發現利福平血藥濃度對肺結核患者機體免疫水平存在一定的影響。T細胞免疫有中心調控作用，能反映機體細胞免疫狀態，其中CD4+T細胞屬于輔助性淋巴細胞，能促進多種細胞因子大量分泌，增強細胞免疫反應，與NK細胞具有協同作用；CD8+T細胞包括抑制性T細胞與殺傷性T細胞，二者會引起免疫應答抑制效應，促使可溶性抑制因子大量分泌，經分泌穿孔素或直接殺傷作用將感染細胞殺死；CD4+/CD8+比值為評估患者細胞免疫功能的關鍵參考指標，若CD4+/CD8+比值下降，則提示細胞免疫失衡，表明患者免疫功能低下[16]。而Treg細胞能抑制Th1細胞免疫反應，減少IFN-γ分泌，抑制機體免疫應答。胡群英等[17]通過檢測結核病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細胞水平，結果顯示，與健康對照者比較，肺結核患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細胞數量明顯增加，并證實其能抑制PBMC及CD4+CD25+T細胞對BCG的增殖反應及細胞因子的分泌，促使Th1細胞免疫反應受抑，表明其在結核免疫中具有重要作用。而MDSC屬于一群免疫抑制性細胞，在外傷、炎癥等病理狀態下，其數量明顯升高，能抑制免疫細胞應答，誘導Treg形成，間接抑制機體免疫應答。有報道，在不明顯改變用藥安全性前提下，需增加利福平用藥劑量，促使其血藥濃度高于最低抑菌濃度，從而提高其殺菌及抑菌活力，增強療效[18]。筆者認為，高濃度利福平能有效殺滅結核分枝桿菌，調節T淋巴細胞發育、分化及成熟，并修復受損T淋巴細胞，活化CD4+T、CD8+T細胞，抑制TNF-α、CRP、IL-6、IL-10等炎癥因子，促進機體免疫功能恢復。

本研究結果顯示，觀察組強化期結束時、治療結束時及結束后1個月痰菌轉陰率明顯高于對照組，證實利福平血藥濃度升高可有效提高復治涂陽肺結核患者痰菌陰轉率。有報道，感染部位組織中的藥物濃度與藥物療效密切相關，為確保組織中能達到有效治療濃度，藥物血藥濃度應達到致病菌最低抑菌濃度的2倍及以上[19]。藥物必須在病灶部位達到足夠濃度，才能殺滅或抑制組織深部潛伏的致病菌，而藥物進入組織中的濃度與局部血流量、藥物理化特性、血漿蛋白結合率等因素相關[20]。利福平血藥濃度升高，具有雙重抗菌機制，能殺滅代謝旺盛期及靜止期結核菌，結合依賴DNA的RNA多聚酶β亞單位，可抑制細菌RNA合成，預防該酶與DNA連接，阻斷RNA轉錄過程，誘導DNA及蛋白合成停止，增強臨床療效[21]。本研究顯示，兩組不良反應發生率比較差異無統計學意義。利福平不良反應以消化道反應為主，一般可耐受，本研究未見嚴重不良反應出現，提示利福平安全性較高，而不同血藥濃度未見顯著差異，可能與樣本量較小有關。需要注意的是，本研究仍存在一些不足之處，如樣本量偏小，干預時間較短，未涉及安全性研究，故今后需開展高質量、多中心、大樣本研究，旨在為臨床治療提供更為可靠的依據。

綜上，不同利福平血藥濃度對肺結核患者免疫功能存在一定影響，臨床上應給予足夠重視。