池塘種植魚腥草對羅非魚鏈球菌抗病力影響及機理研究

季桓濤，祝璟琳，楊 弘，鄒芝英，李大宇，肖 煒，李慶勇，朱德興

(1.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇無錫214081；2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室，江蘇無錫214081；3.廣東省惠州市漁業研究推廣中心，廣東惠州516002)

中草藥含有多種營養物質以及一些免疫活性物質，具有促進攝食率、增重率和增長率、增強肥滿度，降低魚類死亡率等方面作用[1]，可作為魚類飼料添加劑。有研究表明飼料中添加3%和6%魚腥草復方中草藥制劑能增強尼羅羅非魚抗病力[2-4]。鏈球菌病是我國羅非魚的主要病害，近十年來給羅非魚養殖業造成巨大損失[5-6]。當前對羅非魚鏈球菌病控制以抗生素等藥物為主，很難從根本上解決鏈球菌感染，并有藥殘導致的質量安全隱患。

水上栽培技術與羅非魚養殖模式結合，可提高健康養殖效益，已成為羅非魚養殖業重要的關注點。采用生物浮床在池塘表面種植中草藥，是目前興起的生物防控技術手段，可實現對水質的調控，調節養殖魚類非特異性免疫反應。水上栽培也為漁民提供了增加經濟效益的新渠道。目前對羅非魚-魚腥草共培模式缺乏數據和理論支持，需開展不同的魚腥草配置面積對羅非魚代謝、免疫等影響研究，優化并闡明羅非魚-中草藥共培模式。本實驗通過在池塘養殖水面上種植不同面積的魚腥草，研究了魚腥草對羅非魚抗病力影響，篩選出最適合的種植面積，以期為綠色防控羅非魚鏈球菌病提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設計

實驗魚為吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)，初始體質量為(150±30) g，養殖90 d后感染實驗魚，規格為(297±63) g，實驗基地為廣東省惠州市漁業研究推廣中心。無乳鏈球菌編號為WC1535，由珠江水產研究所惠贈。

在面積為100 m2，深度約為1.6 m的養殖池塘(配有增氧系統)中準備面積為50 m2(5 m×10 m)帆布材質的隔離袋12個，試驗組每3個設為一組，分別標記為A、B、C、D 4個組。每個帆布袋放養均重150 g的羅非魚150尾。魚腥草初始覆蓋面積分別設置為5%(A組)、10%(B組)、15%(C組)、0(D組)，即2.5、5.0、7.5、0 m2，浮床用聚氯乙烯材料(2 m×2 m)制作。養殖實驗準備期，將浮床在池塘中固定，浮床間用細繩連接，將已培育出的魚腥草苗(株高約20 cm)進行扦插，株距保持在20 cm。養殖試驗開始前魚腥草的重量約為50～130 g/m2，養殖實驗結束后約在190～550 g/m2。養殖實驗開始于2017年7月， 9月結束。每天投喂1次，投喂量為魚體重的3%。養殖實驗期間池塘不換水(不包含蒸發補水)。

1.2 人工感染實驗

養殖90 d后，準備24個規格為500 L的養殖桶。取無乳鏈球菌WC1535接種于腦心浸液(BHI)中，28 ℃ 200 r/min培養24 h后，4 000 r/min離心5 min，用滅菌生理鹽水洗滌后配成2.2×108cfu/mL濃度菌懸液。開展感染實驗Ⅰ為不同種植面積魚腥草感染無乳鏈球菌后羅非魚死亡率影響，感染實驗Ⅱ為不同種植面積魚腥草對無乳鏈球菌感染后羅非魚血清生化指標影響。感染實驗期間水溫28.5～30 ℃，天氣晴朗。

人工感染實驗I：每尾腹腔注射2.2×108cfu/mL濃度無乳鏈球菌懸液0.3 mL，每桶魚10尾，每一種植面積設3個重復，連續觀察72 h并記錄死亡尾數。

人工感染實驗II：感染方法同上，每一種植面積設3個重復，每桶魚20尾，實驗期間溶氧保持5 mg/L以上，不投喂。感染開始后每組隨機取2尾瀕死羅非魚，從腦、腎分離病原菌，用梅里埃API 20 Strep試劑條進行快速鑒定。

1.3 感染魚的采樣和處理

腹腔注射感染無乳鏈球菌后，于0、24、48和72 h從每個養殖桶(500 L)中取魚2尾，3個重復桶共取6尾魚，MS-222(200 mg/L)麻醉、尾靜脈取血，室溫靜止4 h后4 000 r/min離心10 min，取血清-20 ℃保存備用。

1.4 血液生化指標測定

在日立7600全自動生化分析儀上檢測下列血清指標：谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、白蛋白/球蛋白(A/G)、葡萄糖(GLU)、膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)，試劑盒購自日本和光純藥工業株式會社產品；堿性磷酸酶(AKP)的試劑盒為購自四川邁克生物科技股份有限公司產品；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒為購自寧波美康生物科技有限公司產品，具體操作按試劑盒上使用說明進行。

1.5 數據分析

實驗數據用Excel 2010進行整理分析，再用SPSS 19.0軟件進行單因素方差(One-Way ANOVA)分析和Duncan’s多重比較檢驗差異性，最后用GraphPad Prism5軟件繪制圖，P<0.05表明差異顯著。實驗數用平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果

2.1 魚腥草種植面積對羅非魚抗鏈球菌病的影響

注射無乳鏈球菌后，4種魚腥草種植面積池的羅非魚都不同程度出現全身發黑、活力低下、皮膚潰爛；感染48 h后，注射魚出現單側突眼混濁、尾鰭損傷、肛門腫大，剖檢可見肝充血腫大、脾腫大、腎腫大。感染魚分離病原菌經API 20 Strep鑒定為無乳鏈球菌。

由圖1可知，不同魚腥草種植面積的感染魚死亡率不同，以D組死亡率最高，顯著高于其他組，72 h累計死亡率達到了88%；B組死亡率最低，72 h累計死亡率為58%，顯著低于其他3組。

圖1 四種魚腥草種植面積下羅非魚感染無乳鏈球菌后的累計死亡率Fig.1 The cumulative mortality of tilapia in four different planting proportions of Houttuynia cordata infected by S. agalactiae

2.2 魚腥草種植面積對無乳鏈球菌感染羅非魚血清ALT和AST影響

由表1可知，4組羅非魚血清感染后血清ALT活力顯著性升高，B組羅非魚血清ALT呈現先升高后降低的趨勢，在感染72 h后血清ALT活力顯著性低于其他3組；4組羅非魚感染后血清AST活力都有顯著性升高，B組羅非魚血清AST呈現先升高后降低的趨勢，C組羅非魚血清AST感染后3 d沒有顯著性變化。A和B組魚腥草種植面積的羅非魚血清AST在感染前至感染后2 d沒有顯著性差異， D組羅非魚血清AST在感染72 h后顯著高于其他3組。

表1 不同種植面積魚腥草對無乳鏈球菌感染羅非魚血清ALT和AST影響Tab.1 The comparison on serum glutamic-pyruvic transaminase and glutamic-oxaloacetic transamnase activities of O. niloticus infected by S. agalactiae in four different planting proportions of H. cordata

2.3 魚腥草種植面積對無乳鏈球菌感染羅非魚血清(A/G)與GLU的影響

由表2可知，A組和B組的羅非魚血清(A/G)在感染后沒有顯著性差異，C組和D組的羅非魚感染后24 h血清A/G顯著性降低，感染前B組的羅非魚血清A/G相比其他3組沒有顯著性差異；4種魚腥草種植面積組的羅非魚血清GLU在感染后顯著性升高，B組的羅非魚血清GLU在感染72 h后恢復到了感染前的水平，沒有顯著性差異，人工感染前的血清GLU水平B組顯著性高于其他3組。

表2 不同魚腥草種植面積對無乳鏈球菌感染羅非魚血清A/G和葡萄糖的影響Tab.2 The comparison on serum A/G GLU of O. niloticus. infected by S. agalactiae in four different planting proportions of H. cordata

2.4 魚腥草種植面積對無乳鏈球菌感染羅非魚血清TC和TG的影響

由表3可知，A、C和D組的羅非魚血清TC在感染后24 h沒有顯著性變化，B組的羅非魚感染后血清TC顯著性降低，4種魚腥草種植面積組的羅非魚在感染前血清TC沒有顯著性差異，A組和B組的羅非魚血清TC在感染48 h和72 h后顯著性低于其他2組；B、C和D組的羅非魚血清TG感染前后24 h沒有顯著性差異，A、B和C組的羅非魚在感染前和感染24 h后血清TG顯著性低于D組。

表3 不同魚腥草種植面積對無乳鏈球菌感染羅非魚血清TC和TG的影響Tab.3 The comparison on serum cholesterol total and glycerin trilaurate of O.niloticus. infected by S. agalactiae in four different planting proportions of H. cordata

2.5 魚腥草種植面積對無乳鏈球菌感染下羅非魚血清AKP和SOD的影響

由表4可知，4種魚腥草種植面積的羅非魚血清AKP在感染后24 h顯著性升高，而B組的羅非魚血清AKP在感染前和感染后24 h和72 h顯著性低于其他3組；4種魚腥草種植面積組羅非魚的血清SOD在感染后24 h顯著性升高，B、C和D組的羅非魚血清SOD在感染72 h后恢復到感染前水平，沒有顯著性差異，而D組的羅非魚血清SOD顯著性高于其他3組，B組的羅非魚血清SOD在感染前和感染48、72 h顯著性低于其他3組。

表4 不同魚腥草種植面積下羅非魚感染無乳鏈球菌后血清AKP和SOD的變化Tab.4 The comparison on serum alkaline phosphatase and SOD activities of O.niloticus. infected by S. agalactiae in four different planting proportions of H. cordata

3 討論

3.1 不同魚腥草種植面積對羅非魚抗鏈球菌病能力的差異分析

本研究改變以往的養殖模式，在水體上種植不同面積的魚腥草，有良好的成效。實驗結果表明，D組的羅非魚感染鏈球菌后死亡率最高，B組的羅非魚死亡率最低，一方面是因為種植魚腥草改善了養殖水體水質，有效地促進了水體自凈功能，這與史麗娜等[7]和鄭堯等[8]的研究結果相符；另一方面羅非魚啃食魚腥草根部，根部釋放生物堿等物質促進機體免疫應答的能力，提高了抗應激能力，進而提高了羅非魚存活率，鄭堯等[9-10]的研究結果也表明羅非魚養殖池塘面積水面種植魚腥草能顯著增強養殖羅非魚IgM、TRF、TNF-α、EGF等免疫功能分子水平，降低羅非魚鏈球菌等病害發生。C組的羅非魚感染鏈球菌后死亡率高于B組，分析原因是高密度種植的魚腥草通過呼吸作用消耗大量養分和分泌過多的生物堿等物質而影響羅非魚的存活率，而鐘全福[11]研究也證實并不是無限制提高浮床植物覆蓋率都對池塘有利。

3.2 不同魚腥草種植面積對無乳鏈球菌感染羅非魚后血清生化指標的變化

血液生化指標是反映魚類生理代謝狀態變化和魚體對病原菌的生理反應，評價魚體健康狀況的重要指標[12]。有研究顯示異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)在感染鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)后血清ALT與AST明顯升高[13]。國內也曾報道歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)患“狂游病”，大黃魚(Pseudosciaenacrocea)被哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)感染后，轉氨酶含量都會顯著升高，其原因是肝臟組織受到損傷[14]。本實驗中，4種魚腥草種植面積組的羅非魚，感染無乳鏈球菌后，細胞中大量轉氨酶逸入血液，血清ALT和AST都出現顯著性升高，說明肝臟在感染后受到了損傷，沒有種植魚腥草組ALT在感染后顯著性高于其他種植魚腥草的組，而C組的羅非魚血清ALT和AST在感染前最大，C組的羅非魚血清AST在感染后期也顯著性高于其他3組，說明C組的羅非魚可能在感染前肝臟已經產生了脅迫損傷，B組的羅非魚血清ALT和AST呈現先升高后降低的趨勢，感染后72 h恢復到感染前水平，分析原因可能是種植魚腥草去除了水體的氮、磷，減輕了氨氮對羅非魚的脅迫，從而增加了組織細胞對外界刺激的耐受性，另外魚腥草釋放免疫活性物質刺激機體產生免疫代謝，降低肝臟受損程度。

血液中的GLU是生命體進行生化代謝活動所需能量的來源之一，也是維持生命穩定的重要能源之一，在機體的正常生理代謝活動下，機體內含量相對穩定，但會隨著機體活動和環境因子的改變而變化。因此血液中GLU的含量可作為魚體響應環境應激因子的指示指標[15]。本實驗中4種魚腥草種植面積組的羅非魚血清GLU在感染后都有顯著性的升高，說明羅非魚機體為抵抗病原菌的入侵增加了對葡萄糖的需求，以應對免疫反應消耗的能量，因此血液葡萄糖含量呈現上升趨勢。Chen等[16]研究也發現，使用創傷弧菌(Vibriovulnificus)和海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)感染尼羅羅非魚后，血清中葡萄糖水平顯著高于對照組。10%魚腥草種植面積的羅非魚血清GLU在感染72 h后恢復到感染前的水平，說明魚腥草在感染后期對魚體抵御病原菌起到一定輔助作用。但是也有一些魚類感染病原菌葡萄糖呈現下降趨勢[17]，可能是病原菌感染后魚類開始食欲減退不進食，導致血清GLU水平降低。人工感染前的血清GLU水平，B組顯著性高于其他3組，感染3 d后恢復到感染前水平，分析原因為羅非魚食用魚腥草根部提高了感染前血清中的GLU水平。實驗結果表明，B組對血糖水平有更好的調控作用[18]。

血清蛋白能夠起到維持體內內環境的穩定，調節酸堿平衡和引導物質的運輸，并且維持血漿正常的機體滲透壓的作用。因此ALO和GLO含量的變化可以作為魚類應對外界刺激做出反應的參考指標[19]，A/G比值可以作為衡量機體正常的蛋白質維持程度的重要指標[20]。祝璟琳等[21]研究表明埃及尼羅羅非魚在高溫應激下感染無乳鏈球菌后A/G的比值有下降趨勢。本實驗中D組的羅非魚血清A/G在感染后顯著性降低，強俊等[20]研究也表明埃及尼羅與紅羅非魚隨鏈球菌感染時間的延長，A/G比值基本呈下降的趨勢。羅輝等[22]研究表明齊口裂腹魚感染嗜水氣單胞菌后72 h內血清A/G的比值先升高后降低。本研究中面積為“0”組的羅非魚血清的A/G呈現先升高后降低的趨勢，說明魚腥草種植超過一定面積，某些活性物質的過量累積可能對羅非魚免疫應激能力產生副作用，而A組和B組的羅非魚血清A/G在感染前后沒有顯著性差異，說明可能魚腥草中的生物堿等物質對蛋白的維持度較好[18]，提高了羅非魚對病原菌的應激。

AKP屬于溶酶體酶的一部分，在機體抵御外界不良應激發揮著重要作用[23]，本實驗中羅非魚血清AKP都是呈現先升高后降低的趨勢，10%魚腥草種植面積的羅非魚血清AKP在感染前和感染后24、72 h都要顯著性低于其他3組，羅非魚在感染后機體的代謝活動加劇用來抵御病原菌的侵襲。說明無乳鏈球菌感染前后對B組的代謝影響最小。 SOD能夠及時清除體內的氧自由基，促進機體免疫調節的能力，能夠清除對機體有危害作用的物質，防御過氧化損害，提高免疫力[24]。本實驗中4種種植面積的血清SOD在感染后都有顯著性升高，魚體受到病原菌侵襲后激活了SOD的誘導酶，導致上升。B組的羅非魚血清SOD在感染前和感染48、72 h都顯著性低于其他3組，說明可能種植魚腥草讓羅非魚提高了對外界刺激的耐受力，阻礙誘導酶激活，介導各種免疫反應。實驗結果表明，B組的羅非魚在抗病能力上優于其他3組。

TG和TC水平的變化也可以作為魚類對外界刺激或病毒感染的反應。血清TG和TC主要來源于腸道吸收脂質和肝臟脂肪代謝[25]。徐曉津等[26]研究發現，當大黃魚感染哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)后，血清中TG和TC的水平顯著性低于對照組。這與本試驗結論相似，本實驗中A、C和D組的羅非魚血清TC在感染后24 h沒有顯著性變化，在感染后期出現下降趨勢，B組的羅非魚感染后血清TC顯著性降低，這說明可能在感染后增加了對TC的利用以抵抗病原菌，滿足自身需要的能量，在感染后期隨著肝臟的損傷，也可能引起血清中TC的下降。A組的羅非魚血清TG感染后呈現持續降低的趨勢，A、B和C組的羅非魚在感染前和感染后24、48 h血清TG顯著性低于D組，這和陳寅兒等[27]的研究中鱸(Lateolabraxjaponicus)感染病原菌后血清中甘油三酯明顯低于對照組的結果相似，證實B組的羅非魚更能有效地調節血清TC和TG，以應對外界刺激。

4 結論

B組死亡率最低，血清生化指標優于對照組和其他魚腥草種植面積組。羅非魚-魚腥草共培養殖模式魚腥草的最佳覆蓋比例為10%。