鯉浮腫病檢測方法實驗室間比對的結(jié)果與評價

陳孝宇，陳 鑫，王津津，范引光，曾憲東，鄭 劍

(1.武漢海關(guān)，武漢 430050；2.深圳海關(guān)，深圳 518045；3.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，合肥 230032)

鯉浮腫病毒(carp edema virus)于1974年在日本新瀉的一個錦鯉養(yǎng)殖場首次發(fā)現(xiàn)，自2009年開始，在英國、法國、德國、波蘭等歐洲國家，陸續(xù)發(fā)生了鯉科魚類因感染CEV而爆發(fā)性死亡[1-3]。在亞洲的印度和韓國也相繼出現(xiàn)鯉浮腫病感染病例報道[4，5]。2014年7月，在北京房山某養(yǎng)殖場發(fā)現(xiàn)鯉浮腫病臨床癥狀疑似病例，經(jīng)電鏡觀察和PCR產(chǎn)物測序及比對，確診該病是由CEV感染引起的鯉魚浮腫病[6]。感染CEV的發(fā)病魚身體浮腫，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的嗜睡癥狀，浮于水面或沉入池底，器官水平可見鰓損害、凹眼、皮膚損害等癥狀，因此該病又被命名為錦鯉昏睡癥(koi sleepy disease， KSD)，該病發(fā)病水溫范圍廣，7～25 ℃均有報道。CEV是一種雙鏈DNA病毒，屬于痘病毒科，根據(jù)CEV 4a基因片段遺傳分析，將其分為三個基因型：基因型I和IIb型僅感染普通鯉，IIa型感染普通鯉和錦鯉[3，7]。錦鯉感染CEV后有典型的臨床癥狀，導(dǎo)致很高的致死率；但普通鯉對CEV卻有很強(qiáng)的耐受性，種群致死率較低[8]。隨著CEV的流行趨勢漸廣，在不同應(yīng)用場景下，最適檢測方案的選擇尤為重要，但目前尚未有CEV現(xiàn)場快速檢測的方法報道。本研究旨在利用實驗室間比對，比較鯉浮腫病不同檢測方法的檢出限，為防疫機(jī)構(gòu)提供有效的檢測手段，為開展流行病監(jiān)測奠定方法基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病魚樣品

2017年6月收到來自湖南省的3個樣品，每個樣品隨機(jī)采樣錦鯉150尾，采樣水溫25～27 ℃。部分錦鯉有昏睡癥狀，以及眼球凹陷和體表潰爛等其他臨床癥狀。

1.2 主要試劑與儀器

基因組DNA提取試劑盒購自天根公司；Taq酶購自Takara公司，Bst酶購自NEB公司；引物、探針均由Invitrogen公司合成。PCR儀和熒光PCR儀購自ABI公司，電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-rad公司。

1.3 核酸提取

取魚鰓和肝脾腎等內(nèi)臟組織，低溫研磨，采用基因組DNA提取試劑盒抽提DNA，方法參見說明書，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CEV的套式PCR檢測方法

采用Matras等[3]建立的CEFAS套式PCR方法，第一輪擴(kuò)增引物序列為：F1：5′-ATGGAGTATCCAAAGTACTTAG-3′，R1：5′- CTCTTCACTATTGTGACTTTG -3′；第二輪擴(kuò)增引物序列為：F2：5′- GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG -3′ R2：5′- TAGCAAAGTACTACCTCATCC -3′。兩輪擴(kuò)增反應(yīng)條件一致：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。配置1.5%瓊脂糖膠， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.5 CEV的 LAMP檢測方法

采用經(jīng)鑒定的CEV核酸，以及選取錦鯉皰疹病毒，鯉皰疹I(lǐng)I型病毒和鯉春病毒血癥病毒等常見鯉科魚病毒作為參照進(jìn)行特異性實驗。LAMP擴(kuò)增的外引物為F3：5′- GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG-3′，B3：5′- CAAATTTGAGATTACATTCTGTGG -3′；內(nèi)引物為FIP：5′- TGGGAAGGATTTTATGCTAATGGAAATCGTTTGTTACCTTTTGTAGT-3′，BIP：5′- TGTAGCATTTCCTAGTTTGTATGGCCAAATTCCTCAAGGAGTTGC -3′。反應(yīng)條件為63 ℃等溫擴(kuò)增60 min，80 ℃終止反應(yīng)5 min。瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。

1.6 CEV的熒光定量檢測方法

熒光定量PCR采用Matras等[3]建立的CEFAS qPCR方法，引物為F:5′-AGTTTTGTAKATTGTAGCATTTCC-3′，R:5′-GATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA-3′，探針為5′-FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ1-3′，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。

1.7 室間比對方案

參試實驗室需分別對所分配到的4份樣品進(jìn)行核酸濃度測量，并選擇不同的基因擴(kuò)增方法進(jìn)行檢測，對4份樣品分別作出定性的判定，并且要求10倍梯度稀釋陽性樣品，進(jìn)一步比較方法之間檢出限的差異。

1.7.1 樣品

設(shè)計陰性和陽性兩種CEV核酸樣品：陽性樣品為含CEV病毒核酸的基因組，由感染CEV的病魚鰓組織中提取；陰性樣品為感染白斑綜合征(white spot disease，WSD)的克氏原螯蝦基因組。將提取的核酸溶于TE溶液中，混勻后再分裝而成，-40 ℃冷凍保存。按照《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》所規(guī)定的檢驗方法和要求，隨機(jī)選取待檢樣品進(jìn)行定性檢測，并對陽性樣品進(jìn)行核酸濃度的均勻性和穩(wěn)定性檢測。

分別從陽性樣品中隨機(jī)抽取了10份樣品進(jìn)行均勻性檢測。穩(wěn)定性檢驗跨度6 d，測定時間為每天，設(shè)置三個模擬環(huán)境：低溫組4 ℃，常溫組25 ℃，高溫組37 ℃。每份樣品采用紫外分光光度法進(jìn)行濃度檢測，重復(fù)檢測2次。

1.7.2 檢測方法：

套式PCR、LAMP和熒光定量方法參照1.4、1.5和1.6。

1.7.3 參試實驗室

對每個參試實驗室賦予唯一性代碼，參試實驗室均以代碼表示，樣品分發(fā)、結(jié)果報告等也均以代碼傳遞。全國有10家實驗室報名參加本次室間比對(表1)，其中原檢驗檢疫系統(tǒng)實驗室7個，以及水產(chǎn)科研院所2個和地方水產(chǎn)機(jī)構(gòu)的實驗室1個。

表1 參試實驗室地區(qū)分布Tab.1 Regional distributions of the inter-laboratory comparison

續(xù)表

2 結(jié)果

2.1 樣品CEV檢測鑒定

電泳可見第一輪套式PCR無明顯擴(kuò)增(圖1

左)，第二輪產(chǎn)物大小約為478 bp(圖1右)，使用DNAman軟件進(jìn)行序列比對，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與編碼CEV膜蛋白的4a基因的同源性(登錄號：KX25404.1；分離株：55-2013)高達(dá)97.90%(圖2)，顯示三個錦鯉樣品均被CEV感染。

圖1 CEV套式PCR檢測結(jié)果Fig.1 Nest-PCR results of CEV detection

圖2 套式PCR產(chǎn)物序列比對Fig.2 Sequence alignment of nest-PCR products

2.2 LAMP特異性

CEV病毒核酸擴(kuò)增出明顯梯形條帶，錦鯉皰疹病毒(koi herpesvirus，KHV)、鯉皰疹2型病毒(cyprinid herpesvirus 2，cyHV-2)、鯉春病毒血癥病毒(spring viraemia of carp virus，SVCV)樣品均未產(chǎn)生有效擴(kuò)增(圖3)，顯示LAMP方法特異性良好。

圖3 LAMP特異性結(jié)果Fig.3 Specific results of LAMP

2.3 測試樣品的均勻性和穩(wěn)定性評價

陽性和陰性樣品的CEV定性檢測結(jié)果全部相符，對陽性樣品核酸濃度值經(jīng)單因子方差統(tǒng)計分析：計算得F陽=0.650，查表得F0.05(9，10)=2.35，F(xiàn)陽顯著小于F0.05(9，10)，結(jié)果表明在0.05顯著性水平時，陽性樣品是均勻的，平均濃度為679.659 μg/mL(表3)。

表3 陽性樣品核酸濃度均勻性實驗Tab.3 Test for homogeneity of nucleic acid concentration of positive samples

采用t檢驗法評定樣品的穩(wěn)定性，樣品存放6d后檢測結(jié)果計算：t低溫=0.732，t常溫=0.491，t高溫=0.466，均小于t0.05/2，12=2.179。表明所有樣品經(jīng)模擬低溫、常溫、高溫運(yùn)輸6 d，檢測結(jié)果無顯著性變化，樣品穩(wěn)定性良好(表4)。

表4 陽性樣品核酸濃度穩(wěn)定性實驗Tab.4 Test for stability of nucleic acid concentration of positive samples

2.4 實驗室比對結(jié)果統(tǒng)計

本次室間比對共收到10個參試實驗室的結(jié)果報告，經(jīng)與已知結(jié)果值對照，參試實驗室均上報了正確的定性檢測結(jié)果，其中有9家選擇了套式PCR檢測方法，10家全部都選擇了熒光PCR檢測方法，2家選擇了LAMP方法。所有檢測限判定的有效結(jié)果統(tǒng)計見圖4，計算其稀釋倍數(shù)的加權(quán)平均值可得：LAMP法為50倍稀釋，最高可達(dá)102倍稀釋；熒光PCR法為380倍稀釋，最高可達(dá)103倍稀釋；而套式PCR法為1 225倍稀釋，最高可達(dá)到104倍稀釋，其檢測限可低至6.8×10-10g核酸樣品。

圖4 室間比對檢測限Fig.4 Detection limit of inter-laboratory comparison

3 討論

實驗室間比對其目的除了確定實驗室進(jìn)行特定檢測的能力以外，可通過對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定新的檢測方法的有效性和可比性[9]；而能力驗證是利用實驗室間比對，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則開展的活動。在動物檢疫領(lǐng)域，由國家認(rèn)監(jiān)委等機(jī)構(gòu)組織的能力驗證，針對病原的核酸檢測主要為定性比對，僅部分酶聯(lián)免疫吸附檢測方法為定量比對，其目的是評價參加者的能力，其結(jié)果運(yùn)用于檢驗檢測機(jī)構(gòu)的認(rèn)可和資質(zhì)認(rèn)定。本研究設(shè)計定量比對方案，并且組織了10家實驗室進(jìn)行樣品的定性判定，在保證陽性樣品CEV核酸濃度均勻穩(wěn)定的前提下，對不同方法的檢測限結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

目前尚未發(fā)現(xiàn)和建立敏感細(xì)胞系，無法進(jìn)行CEV病毒分離實驗，檢測手段主要是核酸檢測。本次實驗室間比對采用CEFAS建立的套式和熒光PCR方法[10]，其引物設(shè)計在p4a基因的相對保守片段上，是目前實驗室條件下，檢測已知CEV全部基因型的最佳方法。Oyamatsu等[11]建立的套式PCR方法，檢測基因型I型CEV時，結(jié)果顯示有雜帶干擾，無法有效判定結(jié)果，在檢測IIa型時有漏檢。Adamek等[12]建立的熒光PCR方法，在檢測I型CEV時，假陰性結(jié)果較多，且IIa型有漏檢。

熒光PCR法無需進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，利用收集熒光探針信號來判定靶基因擴(kuò)增與否，該方法實驗流程更少，但對儀器成本要求更高，且熒光探針的成本要遠(yuǎn)高于引物。套式PCR是傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增方法，兩輪PCR可有效擴(kuò)增靶基因，且產(chǎn)物可

經(jīng)測序進(jìn)一步驗證結(jié)果可靠性。由該次室間比對的全部參試結(jié)果統(tǒng)計分析可得，CEFAS套式PCR方法靈敏度最高，適用于實驗室檢測；LAMP法快捷有效，對儀器要求最低，可適用于現(xiàn)場檢測。但此次比對結(jié)果顯示，LAMP法檢測限尚不夠低，須通過設(shè)計環(huán)引物和調(diào)整擴(kuò)增體系中甜菜堿濃度等方法，進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件，提高其檢測靈敏度。

目前CEV的全基因組序列尚未公布，遺傳背景也未完全了解，急需搜集陽性樣品和開展流行病學(xué)調(diào)查，進(jìn)行毒株進(jìn)化分析，以更好地開展鯉浮腫病防治研究。本研究建立了現(xiàn)場快速檢測方法，同時為在不同應(yīng)用場景下，選擇CEV最適檢測方法提供了理論依據(jù)。