鹽酸四環素標記斑馬魚耳石效果及對抗氧化力的影響

郭 鶴，徐莉佳，葉 勤，陶怡曦，蘇 英，吳榮華，3，李 云，3

(1.西南大學動物科技學院，重慶三峽生態漁業產業技術研究院，重慶400715；2.西南大學化學化工學院，重慶，400715；3.西南大學淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，重慶400715)

增殖放流中關鍵的組成部分是標志與回捕鑒定技術[1]。目前，魚類標志技術主要有外部、內部、化學、生物和分子標記等主要種類[2-3]。化學標記技術可在短期內標記大量魚種，并且具有效果顯著、成本低、對標記對象傷害較小的優點，故在漁業增殖放流和水產養殖中得到了更廣泛的應用和發展[4]。其中，熒光染料技術利用熒光物質可在魚體的鈣化組織(如鱗片、耳石、鰭條等)上沉積以產生熒光標記的特點，已在標記生長率調查、年齡確認和種群與區域鑒定方面的研究中得到了較好的應用[5-8]。目前，鹽酸四環素(TCH)、茜素、茜素絡合物、鈣黃綠素等熒光染料已被廣泛應用于魚類的增殖放流標記，不同魚類對不同染料的耐受性和敏感性也存在較大差異[9-12]。

TCH因其具有價格低、標記效果顯著、標記時間持久等特點，已在國內外使用40余年[13-15]。熒光染料標記法雖效果顯著，但高濃度和較長時間的浸泡可能對標記魚類產生生理脅迫，對機體造成不同程度的損傷進而影響其生長、發育、行為，最終造成死亡[16-17]。而熒光染料標記對魚類是否會造成生理脅迫和損傷等方面的相關報道甚少，多數研究主要還是側重熒光染料標記魚類的效果和持久度。斑馬魚作為一種模式生物，由于其個體小，繁殖發育周期短，胚胎透明易于觀察，特別是實驗品系具有遺傳背景相同，對藥物反應具有一致性等特點，被廣泛用做毒理實驗模型[18]。因此，本研究以斑馬魚為研究對象，考察其對TCH染料的敏感性以及在不同濃度和浸泡時間下的標記效果和抗氧化酶活性的影響，并對TCH標記魚類進行效果和安全評估。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

本實驗室自行培養和繁殖的野生AB系斑馬魚稚魚(平均體長10 mm，25日齡)。養殖水溫為28.5 ℃，光周期為14 L∶10 D，每天定時投喂兩次且浸泡前后均保持正常投喂和相同光照條件。飼養方法參照《The Zebrafish Book》[19]。

1.2 熒光標記浸泡方法

將TCH試劑(上海生工生物工程公司)與養殖水體按比例混勻，制備成體積為10 L，濃度分別為0(對照組)、100、150、250 mg/L的TCH浸泡液，pH均調至7.0。隨后每組中各加入200尾健康的斑馬魚稚魚，使浸泡密度為20尾/L。

1.3 樣品處理

浸泡后的第1、3、6、9、15、30 d，取出各濃度處理組的斑馬魚矢耳石和微耳石，清洗后置于熒光顯微鏡(Leica DMIL LED)下進行觀察和拍照。參照歐陽斌等[20]的研究方法確定耳石的標記效果。同樣時間點，隨機取各濃度和浸泡時間處理組的12尾稚魚，按照1∶9的質量體積比，加入配制好并預冷的淡水魚用生理鹽水。在冰上進行勻漿處理后，以4 000 r/min的轉速于冷凍離心機(4℃)中離心10 min，取上清液檢測。用SOD、CAT、GSH-P x和總蛋白測試盒(南京建成生物工程研究所)測定抗氧化酶活性。

1.4 數據分析

實驗結果用回歸方法做相關性檢驗，采用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)和最小極差法(LSD)進行分析和比較組間差異平均值，統計結果中P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 TCH標記斑馬魚耳石的效果

在綠色激發光N2.1和藍色激發光I3下觀察斑馬魚耳石的標記效果[21]。結果顯示，150 mg/L和250 mg/L 的TCH浸泡液對斑馬魚耳石標記率均為100%，TCH對斑馬魚微耳石的標記效果比矢耳石的標記效果明顯(表1)。

斑馬魚微耳石的熒光照片顯示如圖1，(矢耳石的熒光圖略)，濃度為0、100、150、250 mg/L TCH浸泡18 h(1-A)和24 h(2-A)，耳石的熒光標記強度與濃度呈正相關。浸泡18 h時，250 mg/L濃度的TCH浸泡液標記斑馬魚耳石的效果最好。浸泡24 h時，150 mg/L和250 mg/L濃度組的標記效果均很明顯，標記輪紋在第15 d時就已非常清晰(2-15A)。

表1 TCH浸泡標記斑馬魚耳石的效果Tab.1 Results of otolith marking in Danio rerio with TCH immersion

2.2 TCH標記后斑馬魚的抗氧化酶活性的變化

2.2.1 SOD活性的變化

100 mg/L濃度處理組浸泡18 h的斑馬魚的SOD活性，在浸泡后的第1、3、6、9、15 d均與對照組無顯著性差異；150 mg/L處理組的SOD活性在第3 d時顯著升高，在第6 d時達到最大值；250 mg/L處理組在第3 d時SOD活性達到最大，在第15 d時恢復到對照組水平。

浸泡時間為24 h，中低濃度組(100 mg/L、150 mg/L)斑馬魚在浸泡后的第1 d，SOD活性有極顯著的提高，高濃度組SOD活性在第1 d時顯著降低，但在第3 d時顯著升高。在隨后各時間點的檢測中，各濃度處理組SOD活性隨時間呈下降趨勢，最終在15 d時恢復到對照組水平。結果表明，延長浸泡時間，加快了斑馬魚體內SOD活性的誘導，但高濃度長時間的浸泡可能會短暫抑制其酶活性，對魚體造成短期內可恢復的氧化損傷。

圖1 不同濃度TCH溶液浸泡處理18 h和24 h后1、15、30 d的微耳石熒光標記圖Fig.1 Fluorescencephotomicrographs of lapilli at 1， 15， 30 days after immersion for 18 hours and 24 hours in different concentrations of TCH solution

圖2 TCH 浸泡處理18 h和24 h后斑馬魚SOD活性的變化(*P<0.05， **P<0.01為與對照組比較檢驗，下同)Fig.2 Changes of 18 hour and 24 hour immersion treatment of TCH on SOD activity in Danio rerio

2.2.2 CAT活性的變化

100 mg/L和150 mg/L濃度TCH浸泡斑馬魚18 h，對其CAT活性無顯著影響；250 mg/L處理組的CAT活性在浸泡后的第3 d顯著升高。浸泡時間為24 h時，各濃度處理組在第3 d時的CAT活性均極顯著升高。在第9 d時，中低濃度組的CAT活性恢復為對照組水平，而高濃度組的CAT活性顯著低于對照組，在15 d時才恢復正常，表現出先誘導后抑制再恢復的趨勢。這一結果表明，用250 mg/L濃度TCH浸泡24 h可能對魚體產生了一定氧化損傷，但并非不可逆的氧化損傷。

圖3 TCH 浸泡處理18 h和24 h后斑馬魚CAT活性的變化Fig.3 Changes of 18 hour and 24 hour immersion treatment of TCH on CAT activity in Danio rerio

2.3.3 GSH-Px活性的變化

浸泡處理18 h后，100 mg/L TCH處理組的GSH-Px活性在各個時間點均與對照組無顯著差異；150 mg/L和250 mg/L處理組的GSH-Px活性均在第1 d被顯著誘導升高，并分別在第6 d和第3 d 時GSH-Px活性達到最大，在第9天時降低，但150 mg/L濃度處理組GSH-Px活性在第9天時仍然為顯著升高狀態，最終均在第15天時恢復至對照組水平。

浸泡時間延長后，100 mg/L濃度組的GSH-Px活性被誘導，在浸泡后的第3天時顯著升高并達到最大值；250 mg/L濃度處理組GSH-Px活性在第1、3、6、9天均被顯著誘導升高，誘導持續時間明顯延長。在第15天時，各濃度組GSH-Px活性均恢復為對照組水平。結果表明，延長浸泡時間至24 h后，GSH-Px活性出現被誘導現象開始的時間會隨浸泡液濃度的升高而提前。

圖4 TCH浸泡處理18 h和24 h后斑馬魚GSH-Px活性的變化Fig.4 Changes of 18 hour and 24 hour immersion treatment of TCH on GSH-Px activity in Danio rerio

3 討論

3.1 TCH標記斑馬魚耳石的效果

熒光染料可實現大量增殖放流魚種的快速標記，且標記持續時間較長。但同時不能忽視熒光染料的濃度及浸泡時間對魚類造成的脅迫和生理損傷[21-22]。不可逆的生理損傷和高強度的環境因子脅迫均可增加魚種的死亡率，從而導致增殖放流效果不理想。本實驗結果表明，150 mg/L 和250 mg/L 濃度的TCH對斑馬魚耳石的標記效果明顯。綜合考慮到成本、標記效率及效果，標記時可采用250 mg/L濃度TCH浸泡18 h或150 mg/L濃度TCH浸泡24 h的方法。以往也有研究表明，四環素標記稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)、彭澤鯽(Carassiusauratusvar.Pengze)[20]和許氏平鮋(Sebastesschlegelii)[23]的效果較好。因此，推測TCH熒光標記可以應用于其他魚類的標記，并且可為后續的追蹤和調查提供準確的標記信息。

3.2 TCH標記對斑馬魚的抗氧化酶活性的影響

高濃度的抗生素會對水生生物產生毒害作用，TCH作為一種抗生素，必然會在生態安全性方面受到更多關注[24]。章強[25]研究表明，四環素96 h的急性暴露，明顯抑制了斑馬魚胚胎的生長發育，并且四環素(10～200 μg/L)導致斑馬魚幼魚SOD和CAT基因表達量顯著上調，體內ROS含量明顯上升。活性氧(ROS)主要包含超氧陰離子(·O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(·OH)。當魚體受環境脅迫因子刺激時會產生氧化應激反應，其體內的抗氧化酶SOD和CAT會催化O2-和H2O2發生歧化反應，防止有害物質·OH的生成，GSH-Px可被H2O2氧化生成H2O，同時將還原性谷胱甘肽(GSSG)變成氧化型谷胱甘肽(GSH)。當機體受到嚴重脅迫時，抗氧化酶活性被抑制，導致體內大量的ROS無法被及時清除，從而對脂類、蛋白質、核酸等產生不可逆損傷[26-27]。因此，機體的抗氧化酶活性能有效反映出外源因子對機體脅迫和損傷的狀況[28-30]。

本研究結果顯示，各濃度處理組主要誘導了斑馬魚的抗氧化酶活性提高，出現低濃度誘導，高濃度抑制的現象，但總體上抗氧化酶活性表現為先誘導升高而后隨時間延長呈逐漸恢復為對照水平的趨勢，這與四環素對纖毛蟲(Ciliate)[31]、銅綠微囊藻(Microcysitisaeruginosa)[32]抗氧化酶活性影響的結果相似。吳金明等[33]對茜素紅標記中華倒刺鲃(SpinibarbusSinensis)抗氧化酶活性影響的研究中也得到了相似的結果。本實驗中，150 mg/L濃度組的抗氧化酶活性被誘導的時間遲于250 mg/L濃度組，并且恢復至正常水平的時間相對于高濃度組滯后，可能由于高濃度的TCH溶液刺激魚體內SOD和GSH-Px抗氧化酶產生協同作用，快速清除體內多余的氧自由基，縮短酶活性恢復至正常水平的時間。另外，本實驗中SOD和GSH-Px活性的誘導呈現出同步性，CAT活性的誘導相對滯后，可能是由于CAT與SOD和GSH-Px的響應模式不同。Livingstone等[34]在沙丁魚上也觀察到SOD與CAT的響應模式不相同的現象。

本研究中，低濃度TCH溶液18 h的浸泡對斑馬魚的抗氧化酶活性無影響，但加長浸泡時間為24 h后，其抗氧化酶活性均被顯著誘導升高。250 mg/L組SOD活性在浸泡18 h后第1天沒有被顯著影響，而在浸泡24 h后，SOD活性在第1天時被顯著抑制，在第3天時又被誘導升高；CAT活性在第6天出現極顯著升高后，第9天又出現極顯著抑制的情況，在第15天時又均恢復至正常水平，且各濃度下延長浸泡時間可使SOD和GSH-Px活性的誘導提前。分析可能由于高濃度及長時間的浸泡刺激使魚體內其他抗氧化酶或抗氧化系統被激活，平衡了體內過多的氧自由基，從而解除了SOD活性的抑制，使其又恢復到被誘導的狀態。

綜上，斑馬魚對TCH的敏感性高且標記效果顯著，其中150 mg/L和250 mg/L濃度TCH溶液浸泡18 h標記斑馬魚的效果最佳，且沒有對魚體產生氧化損傷。綜合考慮TCH適合作為一種性價比較高的熒光染料應用于增殖放流魚苗的大規模標記工作。