松花粉提取物對胰島素抵抗HepG2細胞糖脂代謝的影響

趙可心，夏凱，苑鵬，溫霖，李愛民，李永強，段盛林*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015)2(國珍健康科技(北京)有限公司，北京，102206) 3(功能主食創制與慢病營養干預北京市重點實驗室，北京，100015)

胰島素抵抗是指胰島素作用的靶器官對胰島素的敏感性下降，即正常劑量的胰島素產生低于正常生物學效應的一種狀態，主要表現為葡萄糖攝取減少及糖原的合成減少。肝臟是人體物質代謝的中樞，也是胰島素作用的主要靶器官。肝臟胰島素抵抗主要表現為肝糖異生、肝糖的輸出增加、甘油三酯釋放量增加及肝臟脂肪變性[1-2]。隨著社會經濟發展和人民生活水平的不斷提高，人們的生活方式發生了巨大變化，代謝綜合征的患病率逐年上升，已成為嚴重危害人類身體健康的十大隱性殺手之一。國外一項針對35～70歲人群的調查表明，患有代謝綜合征的病人，在未來7年里，每8人中會有1人因代謝綜合征而死亡，其中糖尿病導致心血管事件發生的數量是血糖正常者的4.5倍[3]。因此普遍認為，胰島素抵抗是代謝綜合征發病的“共同土壤”，糖脂代謝紊亂是其基礎病理改變，但其具體的發病機制尚不十分明確[4]。

胰島素抵抗是由遺傳和環境因素等多種因素引起的胰島素受體(insulin receptor，InsR)及受體后缺陷所導致的[5]。胰島素由胰島B細胞分泌后，經血液循環送達外周靶細胞，與靶細胞膜上的InsR特異性結合，經過一系列磷酸化以及去磷酸化的過程，順序激活多種激酶，活化胰島素受體底物(insulin receptor substrate 1，IRS-1)，經由磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號通路調節糖代謝[6-8]。通過激活蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)完成下游信號蛋白的級聯效應，促使葡萄糖轉運蛋白4 (glucose transporter 4，GLUT-4)向細胞膜轉位，完成各組織的葡萄糖代謝[9-11]。該通路受到干擾時，會影響胰島素的信號轉導，主要包括胰島素受體活性減弱、胰島素信號轉導的異常、葡萄糖轉運減少、糖原分解增多等。

松花粉是一種傳統的藥食同源的花粉，具有降低血糖，血脂和血膽固醇的含量，預防心腦血管疾病的發生的作用[12-13]。松花粉含有多種維生素、微量元素、多酚，黃酮、酶及輔酶等200余種營養成分及生物活性物質；是迄今為止所發現的天然食品中營養成分最全面的物質之一[14]。松花粉調節糖脂代謝的研究已經有不少報道，但對肝細胞胰島素抵抗的保護作用仍缺乏研究。因此，本研究以松花粉為研究對象，用游離脂肪酸(free fatty acids，FFAs) 誘導人肝癌HepG2細胞建立胰島素抵抗模型，探討松花粉對胰島素抵抗HepG2細胞保護作用及其保護機制，為松花粉的深度開發和進一步充分利用提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松花粉，新時代健康產業(集團)有限公司惠贈；肝癌細胞株(HepG2)，北京協和醫院細胞庫；DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、DMEM無糖培養基、新生牛血清，美國Gibco；油酸鈉(sodium sulfate，OANa)、棕櫚酸鈉(sodium palmitate，PA)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，噻唑蘭(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenylterazolium bromide，MTT)，胰蛋白酶，美國Sigma化學公司；無FFA牛血清蛋白(FFA-free bovine serum albumin，BSA)，日本WAKO公司；RIPA裂解液、TG試劑盒、葡萄糖試劑盒，糖氏試劑盒，碧云天生物技術研究所；TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒、TransScriptR Green One-Step qPCR SuperMix試劑盒，北京全式金生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

倒置生物顯微鏡，日本Olympus公司；生物安全柜，中國濟南鑫貝西生物技術有限公司；37℃ CO2培養箱，日本松下公司；Spectra Max i3酶標儀，美國MD公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司KQ-250DE；pH計，上海雷磁儀器廠；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；DK-8D三溫三控水槽，上海博迅實業有限公司；CFX Connect Real-Time System，美國Bio-RAD公司；超微量核酸蛋白分析儀，英國BioDrop公司。

1.3 方法

1.3.1 松花粉的提取以及分級萃取

取松花粉10 g，置于燒杯中，加入200 mL 70%乙醇溶液，料液比為1∶20(g∶mL)，溫度為30 ℃；超聲波輔助提取2 h；提取液經真空抽濾得到澄清提取液①；在濾渣中繼續加入200 mL 70%乙醇溶液，超聲波輔助提取1 h，真空抽濾得到澄清提取液②；合并提取液①和②，真空旋轉蒸發濃縮，回收乙醇，濃縮后浸膏采用真空冷凍干燥，得到棕黃色硬質膏狀提取物，稱為松花粉乙醇提取物(pine pollen ethanol extract，AC)[15]。

取27 g松花粉按上述步驟處理后得到的浸膏中加入500 mL蒸餾水，溶解后置于分液漏斗中，依次加入等體積的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇進行多次萃??；各不同極性的萃取液合并后，用旋轉蒸發儀減壓濃縮，徹底除去有機溶劑后真空冷凍干燥，得到松花粉的分級部位，按極性自小到大依次為：石油醚相(pine pollen petroleum ether phase，PE)、乙酸乙酯相(pine pollen ethyl acetate phase，AE)、正丁醇相(pine pollen butanol phase，BU)、水相(pine pollen water phase，WT)。

1.3.2 總多酚、總黃酮含量測定

1.3.2.1 總多酚含量測定

采用福林酚法[16]測定總酚，總酚含量用沒食子酸當量GAE (gallic acid equivalent)計。

1.3.2.2 總黃酮含量測定

采用硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法[17]，以蘆丁作為標準品。

1.3.3 HepG2細胞實驗

1.3.3.1 HepG2細胞的培養

人肝癌細胞株HepG2細胞培養于含有10%新生牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養基中，于培養箱37 ℃、5% CO2培養條件下中常規培養。選取對數生長期細胞進行實驗。將細胞以1×106個/mL濃度接種于96孔板，待細胞貼壁并長滿時，用PBS潤洗細胞1次，加入不同的處理液。

1.3.3.2 MTT法測定細胞存活率

取96孔培養板，每孔加100 μL細胞懸液，HepG2細胞濃度為1×105個/mL，37 ℃培養24 h后棄去培養液，用PBS清洗1次，每孔加入不同的處理液100 μL，以無檢測物的相同培養基孵育細胞為對照，培養24 h后除去培養液，加入0.5 mg/mL MTT-DMEM于37℃避光孵育4 h，再加入100 μL DMSO，振蕩混勻以完全溶解出MTT紫色結晶產物。用酶標儀在490 nm處測定吸光度值。以對照組細胞的細胞存活率為100%計算其余組別細胞存活率。

1.3.3.3 實驗分組

實驗分為對照組：25 mmol/L葡萄糖組+10 g/L(質量濃度)BSA、模型組：20 mmol/L葡萄糖+15 mmol/L果糖+1 mmol/L OANa+1 mmol/L PANa +10 g/L BSA組[21]，二甲雙胍組(MET)：造模液中加入終濃度為200 μg/mL二甲雙胍，以及造模液中加入各濃度松花粉提取物的實驗組(終濃度為200或500 μg/mL)。

1.3.3.4 油紅O染色

細胞加樣處理24 h后，棄掉舊培養基，用PBS緩沖液洗去殘余的細胞培養基。而后采用陳亞藍等[18]的方法對細胞進行染色處理。

1.3.3.5 細胞糖吸收測定

各組細胞加樣處理24 h后，小心棄去培養液，用PBS洗1次，換為葡萄糖濃度為12.5 mmol/L DMEM培養基，培養 24 h后取5 μL上清液，用葡萄糖試劑盒測定葡萄糖含量，計算樣品24 h葡萄糖消耗量。

1.3.3.6 細胞內糖原含量的測定

加樣處理24 h后，小心棄去培養液，PBS洗1次，細胞用RIPA裂解液裂解，用糖原試劑盒測定胞內糖原含量。結果除以蛋白含量為最終表示結果。

1.3.3.7 上清液及細胞內TG含量的測定

各組細胞加樣處理24 h后，取50 μL待測細胞上清液，用TG試劑盒測定TG含量，結果以模型組TG含量的百分比表示。

各組細胞加樣處理24 h后，小心棄去培養液，將板內待測定細胞用PBS潤洗2次后，加入RIPA裂解液。充分裂解后，用TG試劑盒測定TG含量。結果以模型組TG含量的百分比表示(%)。

1.3.3.8InSR，PI3K以及GLUT-4 mRNA的表達

采用TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒提取HepG2細胞中的總RNA，檢測其濃度和純度。用TransScriptR Green One-Step qPCR SuperMix試劑盒檢測InSR，PI3K以及GLUT-4 mRNA的表達，以GAPDH為內參。各引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 松花粉提取物得率

松花粉各有效成分提取率如表2所示。

表2 松花粉提取物得率 (n=3)

由表2可知，以上4種萃取物中，WT和PE得率較高。

2.2 松花粉醇提物及分級萃取物中總多酚及總黃酮含量測定

以沒食子酸濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，得到回歸方程為y= 0.048 7x+0.109 4，R2=0.992 7(n=3)，表明沒食子酸在2～25 μg/mL線性良好。以蘆丁濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，得到回歸方程為y=0.006 2x+0.048 3，R2=0.998 8 (n=3)，表明沒食子酸在0～50 μg/mL線性良好。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Rutin standard curve

表3 松花粉提取物多酚、黃酮含量

在以上松花粉萃取物中，AE的多酚含量最高，其次為PE和BU，WT多酚含量最低。其中，AE中多酚含量達1.07 mg/g，是WT的35.7倍。整體而言，松花粉醇提物及萃取物中多酚含量較高。

從黃酮的含量來看，在以上松花粉萃取物中，AE和PE中黃酮含量最高，其次為BU，WT含量最低。其中，AE中黃酮含量是WT的10倍。

2.1 松花粉乙醇提取物及各萃取相對細胞存活力的影響

如圖3所示，在質量濃度為100～500 μg/mL時，AC組，PE組，AE組，BU組和WT組均不影響HepG2細胞的活力，對細胞增殖無明顯影響(P>0.05)?？紤]到后續實驗，因此，各組均選擇低劑量(200 μg/mL)和高劑量(500 μg/mL)2種濃度。

圖3 松花粉醇提物及其萃取物處理24 h對細胞增殖的影響Fig.3 Effect of pine pollen ethanol extract and its extracts on cell proliferation after 24 h n=3)

2.2 油紅O染色結果

油紅O，又稱蘇丹紅5B，是一種脂溶性偶氮染料，具有很強的脂溶性和染脂性，該染料可特異性的與組織內或細胞內的甘油三酯等中性脂肪結合成小滴狀而使脂類物質著色呈現橘紅色，同時又可以避免使細胞內的其他成分與油紅O發生反應而被其染色，以干擾實驗結果[19-21]。

油紅O染色結果表明，對照組細胞與模型組細胞的細胞形態出現明顯差異，模型組細胞內出現油滴發生脂質累積，在模型組中能看到明顯的胞內油滴被染為紅色，說明胰島素抵抗細胞模型構建成功(圖4)。

2.2 松花粉乙醇提取物及各萃取相對細胞上清葡萄糖含量的影響

造模液處理24 h后，模型組細胞上清葡萄糖含量極顯著高于對照組(P<0.01)。提取物與造模液共處理24h后，與模型組相比，AC200組細胞上清葡萄糖水平顯著降低(P<0.05)，其他各實驗組細胞上清葡萄糖水平極顯著降低(P<0.01)。結果表明，FFAs誘導后，HepG2細胞吸收葡萄糖的能力下降，松花乙醇提取物及各萃取相可促進細胞攝取葡萄糖，從而改善細胞的胰島素抵抗水平(圖5)。

2.3 松花粉乙醇提取物及各萃取相對細胞內糖原含量的影響

造模液處理24 h后，模型組細胞內糖原含量含量極顯著低于對照組(P<0.01)，如圖4所示，造模液與提取物共處理24 h后，與模型組相比，各劑量AC組細胞內糖原水平均極顯著提高(P<0.01)，500 μg/mL AC組的糖原含量高于200 μg/mL組，呈現出一定的劑量依賴性；其他各萃取相結果與AC組結果類似，僅200 μg/mL BU組糖原水平與模型組相比無顯著變化。綜上所述，FFAs誘導后，HepG2細胞中糖原快速降解，松花粉乙醇提取物及各萃取相可以抑制細胞內糖原的降解[22]，抑制糖異生途徑，從而改善細胞的胰島素抵抗水平(圖4，圖6)。

圖4 油紅O染色圖(400×)Fig.4 Oil Red O staining (400×)

2.4 松花粉乙醇提取物及各萃取相對細胞內和上清甘油三酯(TG)含量的影響

模型組細胞內TG的含量顯著高于對照組(P<0.01)，如圖5所示，提取物與造模液共處里24 h后，各劑量AC處理組細胞內TG含量與模型組相比極顯著降低(P<0.01)，且樣品濃度越高，胞內TG的含量越低，呈現負相關性；如圖6，AC組上清TG的含量明顯高于模型組(P<0.01)，且500 μg/mL AC組的上清TG含量高于200 μg/mL組，呈現一定的劑量依賴性；其他各萃取結果與AC結果相類似。因此，推測松花粉提取物調節胰島素抵抗HepG2細胞脂代謝是通過將TG從細胞內轉運到細胞外而實現的(圖7，圖8)。

圖5 松花粉乙醇提取物及其萃取物處理24 h對上清葡萄糖含量的影響Fig.5 Effect of pine pollen ethanol extract and its extracts on glucose content in supernatant for 24 h 注：與M組相比，*表示顯示(P<0.05)， **表示極顯著(P<0.01)。

圖6 松花粉乙醇提取物及其萃取物處理24 h對細胞內糖原含量的影響Fig.6 Effect of pine pollen ethanol extract and its extracts on intracellular glycogen content for 24 h注：與M組相比，**表示極顯著(P<0.01)。

圖7 松花粉乙醇提取物及其萃取物處理24 h對細胞內TG含量的影響Fig.7 Effect of pine pollen ethanol extract and its extracts on TG content in cells for 24 h注：與M組相比，**表示極顯著(P<0.01)。

圖8 松花粉乙醇提取物及其萃取物處理24 h對上清TG含量的影響Fig.8 Effect of pine pollen ethanol extract and its extracts on the content of TG in supernatant for 24 h注：與M組相比，**表示極顯著(P<0.01)。

2.5 松花粉乙醇提取物及各萃取相對細胞內總膽固醇(TC)含量的影響

模型組細胞內TC含量明顯高于對照組，為對照組的3.78倍，各劑量AC處理組的細胞內TC的含量極顯著低于模型組(P<0.01)，且呈現一定的劑量依賴性；其他各組結果與AC組類似。其中正丁醇萃取物處理后效果最為明顯，500 μg/mL BU處理組細胞內TC含量最低，約為模型組的12.36%。結果表明，FFAs誘導后，細胞內總膽固醇含量顯著上升，脂代謝出現異常，松花粉具有促進脂代謝，降低細胞內總膽固醇的作用(圖9)。

圖9 松花粉乙醇提取物及其萃取物處理24 h對細胞內TC含量的影響Fig.9 Effect of pine pollen ethanol extract and its extracts on intracellular TC content after 24 h treatment注：與M組相比，**表示極顯著(P<0.01)。

2.6 松花粉對HepG2細胞中InSR，PI3K以及GLUT-4 mRNA表達量的影響。

圖10 松花粉對HepG2細胞中InSR，PI3K以及GLUT-4 mRNA表達量的影響Fig.10 Effect of pine pollen on the expression of InSR, PI3K and GLUT-4 mRNA in HepG2 cells注：與M組相比，*表示顯著(P<0.05)，**表示極顯著(P<0.01)。

與對照組相比，造模液處理24 h后，模型組細胞中InSR，PI3K以及GLUT-4 mRNA表達量顯著下降(P<0.05)，FFAs會導致胰島素受體InSR的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，從而降低活化PI3K的能力，并削弱下游胰島素受體GLUT-4的信號傳導(圖10)，這與SHULMAN的結論相一致[23]。與模型組相比，MET組InSRmRNA表達量顯著上升，PI3K以及GLUT-4 mRNA表達量有一定程度的上調但沒有統計學意義。AC組和PE組PI3K以及GLUT-4 mRNA表達量上調，AE組，BU組和WT組InSR，PI3K以及GLUT-4 mRNA表達量均上調，且組間差異具有統計學意義。說明不同極性的松花粉提取物可以通過調控PI3K/Akt/GLUT-4信號通路促進葡萄糖的轉運，加速糖代謝；AE，BU，WT組還可以上調InSR的表達，增強胰島素的敏感性。

3 討論

HepG2細胞是一種表型與肝細胞極為相似的肝胚胎瘤細胞株，保留了肝細胞的許多生物學特性[24]。大量研究發現，人體出現代謝綜合征與高糖高脂飲食有直接關系。故本文采用果糖、葡萄糖聯合FFAs[25]誘導24 h建立胰島素抵抗模型并給予各劑量不同極性松花粉提取物處理，檢測上清葡萄糖，上清TG，細胞內糖原，TG和TC水平。發現松花粉處理組上清葡萄糖的含量顯著低于模型組，而細胞內糖原的含量顯著高于模型組，說明松花粉能夠促進肝癌細胞吸收葡萄糖，抑制細胞內糖原的降解從而抑制肝糖異生；松花粉處理后細胞內TG和細胞內TC的含量下降，而上清TG的含量上升，說明松花粉可以調節HepG2細胞的脂代謝，其中調節TG代謝可能是通過將TG從細胞內轉運到細胞外實現的。

機體物質代謝幾乎都受到胰島素的調控，一旦產生胰島素抵抗，糖類、脂類和蛋白質代謝都會發生紊亂，胰島素抵抗是機體物質代謝紊亂的共同通路[26]。胰島素進入肝臟后，會與肝細胞膜上的InSR結合，并沿著PI3K/Akt/GLUT-4信號通路發生級聯反應，對肝糖原的合成、分解、糖異生途徑以及血糖穩定起調節作用。二甲雙胍是口服降糖藥物，被廣泛應用于糖尿病的治療。這也是二甲雙胍起作用的主要途徑之一。此外，二甲雙胍還能通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)來實現降糖的作用[27]。本研究以HepG2細胞為研究對象，MET組細胞內InSR的表達量明顯增多，說明MET能夠通過提高HepG2細胞中InSR的表達量來增強胰島素敏感性，但由于本研究采用FFAs誘導HepG2細胞產生胰島素抵抗，在沒有胰島素存在的情況下，胰島素不能與受體的α亞基相結合，從而改變β亞基的構象，進而影響了IRS1/2的磷酸化[28]，因此，下游的PI3K和GLUT-4的表達量增加不明顯，推測本研究中MET調節糖脂代謝主要是通過激活AMPK抑制細胞的合成代謝，調節細胞的能量代謝來實現的[29]。

本研究中AC組和PE組InSR的表達量與模型組相比沒有顯著變化，說明這2組松花粉提取物并非是通過增強胰島素的敏感性來起到降糖的作用，而AE，BU和WT組中InSR的表達量與模型組相比顯著提高，初步認為這3組提取物可以通過提高胰島素的敏感性來起到降糖的作用。PI3K/Akt/GLUT-4信號通路是調節糖代謝的一條重要通路，多種生長因子和信號傳導復合物，包括成纖維細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、人生長因子(HGF)、血管位蛋白I(Ang1)，胰島素以及氧化應激(ROS)都能啟始PI3K的激活過程[30]。很多研究認為高胰島素誘導的胰島素抵抗HepG2模型中IRS1/PI3K/GLUT-4通路被激活，從而起到調節糖代謝的作用。與模型組相比，AE，BU，WT組細胞內InSR的mRNA表達量顯著提高，5種松花粉提取物中PI3K和GLUT-4的含量均顯著提高，說明松花粉提取物能夠激活PI3K/Akt/GLUT-4信號通路，但是本研究中PI3K的激活過程不是由胰島素起始的，推測可能是由于FFAs誘導HepG2細胞產生氧化應激所致，具體誘因有待進一步驗證。