基質濃度對分體式厭氧氨氧化工藝固碳能力的影響

馬雪研，項邦東，張文杰

( 1.桂林理工大學廣西環境污染控制理論與技術重點實驗室，廣西 桂林 541004；2.桂林理工大學廣西巖溶地區水污染控制與用水安全保障協同創新中心，廣西 桂林 541004 )

傳統污水處理廠所采用的生物脫氮處理工藝不僅耗能高，需要添加有機碳源，還會產生較多的CO2氣體,造成溫室效應，并且很難用于處理低碳氮比的廢水[1]。近年來，厭氧氨氧化工藝由于其成本效益高、無需外加碳源等優點[2]，已經逐漸應用于處理高氨氮廢水[3-4]。

(1)

厭氧氨氧化工藝的關鍵微生物——亞硝化細菌和厭氧氨氧化細菌均為化能自養型微生物，具有一定的固碳能力[10]，但厭氧氨氧化菌會受到許多因素的影響使其活性降低，如溫度、溶解氧(DO)、pH值、基質濃度、水力停留時間、亞硝酸鹽抑制作用等[11-12]。Chouten等[13]通過同位素示蹤法和酶活法推斷其固碳方式為Calvin cycle或acetyl CoA途徑。據日本Hitachi Plant Technologies Ltd研究組的報道，厭氧氨氧化工藝的固碳能力不僅受到細菌新陳代謝的影響，還與生化反應的過程等有關[14]。因此，針對厭氧氨氧化工藝的固碳潛力和機理進行研究，對促進微生物增殖的同時兼顧溫室氣體的減排，開發高固碳能力的厭氧氨氧化工藝具有重要的現實意義。

氨與亞硝酸鹽作為厭氧氨氧化反應的底物，若超過一定的濃度范圍，就會成為厭氧氨氧化細菌的抑制劑[15]。本試驗通過改變反應器進水的基質濃度，研究其對短程硝化與厭氧氨氧化耦合工藝短期運行、固碳能力的影響以及在最佳固碳效果時的參數值，可為分體式厭氧氨氧化工藝的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

本試驗采用的分體式厭氧氨氧化試驗裝置如圖1所示。試驗所有反應器裝置均由有機玻璃加工而成，其中R1短程硝化反應器為本研究中的前置工藝，調節pH值在7.55～7.60之間，使用溫度控制系統將反應器溫度控制在(30±1)℃之間，為亞硝化菌提供最適宜的生長條件;R2為沉淀池，用于回流和沉淀，R1出水溢流至內圓柱后，污泥通過重力沉降回流，上清液從外圓柱上的小孔流出;R3為中轉池，向其中添加亞硫酸鈉濃溶液起脫氧作用;R4為上流式折流板厭氧氨氧化反應器，由主體反應器和調節槽構成，主體反應器外側用黑布包裹，防止光線對厭氧氨氧化菌代謝產生不利影響[16]。試驗通過控制反應器內溫度在(30±1)℃之間，保證厭氧氨氧化細菌的活性，溫度通過設置在反應器外部的保溫夾層控制，由溫控系統為反應器持續提供保溫循環水；循環水從反應器底部進入夾層，再從反應器頂部返回溫控系統。

圖1 分體式厭氧氨氧化試驗裝置原理圖Fig.1 Schematic of experimental flow chartR1.短程硝化反應器；R2.沉淀池；R3.中轉池；R4.厭氧氨氧化反應器；1.pH在線監測儀；2.溶解氧在線監測儀；3.攪拌器；4.污泥回流泵

1.2 接種污泥和試驗用水

本試驗中R1、R4反應器中污泥取自實驗室馴化成功的短程硝化污泥和厭氧氨氧化污泥[17-18]，接種污泥數量分別為1 L、1.5 L，接種污泥形態如圖2和圖3所示。

圖2 短程硝化污泥Fig.2 Partial nitrification sludge

圖3 厭氧氨氧化污泥Fig.3 Anammox sludge

階段NH4HCO3KH2PO4NaHCO3CaCl2·2H2OMgSO4·7H2O微生物促進劑(瑞成環保提供)第一階段85501 0001001000.5第二階段14550按需配制1001000.5第三階段18050按需配制1001000.5第四階段24050按需配制1001000.5

注：人工模擬廢水中除微生物促進劑的單位為mL/L外，其余組分的單位均為mg/L。

1.3 分析項目和方法

1.3.1 常規水質指標分析

試驗中，確保出水水質穩定后開始采集水樣。采集的水樣經過0.22 μm濾膜后置于取樣瓶中，取樣后立即檢測或者放置于4℃冰箱保存后統一檢測。水樣中常規水質指標及其測定方法見表2。

表2 常規水質分析項目和測定方法

*注：德國耶拿總有機碳分析儀(multi N/C UV3100)的工作原理是：首先測試樣品的總碳，其次測試樣品的總無機碳，最后得到樣品的總有機碳，該過程中包括無機碳(IC)這一指標，因此選用該種測定方法。

(2)

固碳量=(進水IC-出水IC-單位時間內產生的CO2密度)÷單位時間進入反應器中的氮素量

(3)

式中：IC為水樣中以各種形式存在的無機碳；CO2密度統一采用0℃、101 kPa條件下的數值，其值約為1.977 g/L。

1.3.2 CO2測試分析

本試驗采用上海精科GC-112A型氣相色譜儀對收集的氣體成分進行分析，該儀器使用浙江大學智達信息工程有限公司研發的N(VI)2000色譜數據工作站。CO2標準氣體由上海神開氣體有限公司提供，標準氣體CO2濃度為4.92%,試驗操作條件見圖4。

圖4 CO2標準氣體色譜圖及分析結果Fig.4 Standard gas chromatography of CO2 and analysis results

1.4 微生物種群多樣性分析

本試驗中所采用的污泥來自于基質試驗中4個階段前后兩部分的污泥，一共8個樣品，采樣離心后統一保存于-20℃冰箱中。采用PCR-DGGE分子生物學技術來研究反應器中微生物群落結構的變化，并借此確認分體式厭氧氨氧化工藝中起關鍵作用的功能微生物。此項試驗一共分為三個步驟，分別為核酸提取、PCR擴增和DGGE技術，統一在微生物實驗室中完成，測序則委托上海生物工程有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 短程硝化階段

2.1.1 短程硝化階段的脫氮性能分析

分體式厭氧氨氧化工藝中短程硝化階段進出水氮素濃度的變化，見圖5。反應器中接種已經馴化成功的亞硝化污泥，利用控制DO濃度的方法來控制亞硝化過程的穩定運行，4個階段的曝氣量分別為0.10 L/min、0.18～0.20 L/min、0.38～0.40 L/min和0.50 L/min。

圖5 短程硝化階段進出水氮素濃度濃度的變化Fig.5 Nitrogen relationship between influent and effluent in partial nitrification stage

圖6 短程硝化階段N-N的累積率Fig.6 N-N accumulation rate in partial nitrification stage

2.1.2 短程硝化階段的固碳能力分析

圖7 短程硝化階段IC消耗量與N-N生成量的 關系Fig.7 Relationship between IC consumption and N-N production in partial nitrification stage

y=0.847x+7.074 (R2=0.937,Sig.=0.00)

其中，R2=0.937說明方程擬合度很高，在Anova中符合F校驗；Sig.<0.05，說明顯著性良好，表明兩者之間呈正相關性。

短程硝化反應式如下：

ΔG=-275 kJ/mol

(4)

圖8 短程硝化階段CO2釋放量與N-N生成 量的關系Fig.8 Relationship between CO2 emission and N-N production in partial nitrification stage

y=1.694x-11.884 (R2=0.976,Sig.=0.00)

其中,R2=0.976說明方程擬合度很高，在Anova中符合F校驗；Sig.<0.05，說明顯著性良好，表明兩者之間呈正相關性。

2.2 厭氧氨氧化階段

2.2.1 厭氧氨氧化階段的脫氮性能分析

分體式厭氧氨氧化工藝中厭氧氨氧化階段進出水氮素濃度的變化，見圖9。

圖9 厭氧氨氧化階段進出水氮素的關系Fig.9 Nitrogen relationship between influent and effluent in Anammox stage

為了證實上述假設，本試驗在第四階段后另增設一組試驗，即在進水中增加NaHCO3的量，但處理效果并未得到明顯的改善，故可以排除進水IC值偏低的推測。

根據厭氧氨氧化反應的機理，在純菌條件下，以最佳比例進水的反應器脫氮率約為88.8%。厭氧氨氧化階段總氮去除率的變化，見圖10。

圖10 厭氧氨氧化階段總氮去除率的變化Fig.10 Removal rate of total nitrogen in Anammox stage

由圖10可見，在第一階段中，總氮的去除率較低，這是由于負荷太低會抑制厭氧氨氧化細菌的活性，導致處理效果較差且不穩定；在第二和第三階段中，總氮的去除率均高于80%，表明脫氮效率較高；在第四階段中，由于厭氧氨氧化污泥的濃度不足，導致總氮的去除率降低。

2.2.2 厭氧氨氧化階段的固碳能力分析

迄今為止，已發現的無機碳固定途徑主要有Calvin循環、厭氧乙酰輔酶A、還原性三羧酸循環、3-羥基丙酸和琥珀酰輔酶A 5種途徑[22]。其中，厭氧乙酰輔酶A途徑是近年來在嚴格厭氧細菌中新發現的自養微生物的無機碳固定途徑。圖11為厭氧氨氧化階段中IC消耗量與脫氮量的關系。

圖11 厭氧氨氧化階段IC消耗量與脫氮量的關系Fig.11 Relationship between IC consumption and denitrification in Anammox stage

由圖11可見，厭氧氨氧化反應有較高的固碳能力，隨著脫氮量的增加，厭氧氨氧化反應階段中IC的消耗量也逐漸增大。

以脫氮量為自變量x，IC消耗量為因變量y，利用SPSS軟件進行線性回歸分析，可以得出如下線性擬合方程：

y=0.204x-8.122 (R2=0.842,sig=0.00)

其中，R2=0.842說明方程擬合度良好，在Anova中符合F校驗；Sig.<0.05，說明顯著性良好，表明兩者之間呈正相關性。

y=0.271a+0.089b-9.397 (R2=0.890,Sig.=0.00)

由圖12可見，除第一階段外，CO2釋放量都與脫氮量呈現相同的變化趨勢。第一階段CO2釋放量較高，可能是因為在低負荷下厭氧氨氧化細菌的活性會受到抑制甚至會出現細菌解體的現象，導致產生較多的CO2；而隨后的三個階段中，CO2釋放量的變化趨勢都較為穩定。去掉本試驗中第一階段的數據后，以脫氮量為自變量x，CO2釋放量為因變量y，利用SPSS軟件進行線性回歸分析，可以得出如下線性擬合方程：

圖12 厭氧氨氧化階段CO2釋放量與脫氮量的關系Fig.12 Relationship between CO2 emission and denitrification in Anammox stage

y=0.003x+0.016 (R2=0.936,Sig.=0.00)

其中，R2=0.936說明方程擬合度很好，在ANOVA中符合F校驗；Sig.<0.05，說明顯著性良好，表明兩者之間呈正相關性。

2.3 微生物種群多樣性分析

圖13為本次試驗中短程硝化階段污泥系統發育樹。由于經過長時間馴化，故比較短程硝化各個階段污泥中的微生物種群，并沒有較大區別，且各個階段的條帶強度變化不大。經過分析，在短程硝化階段的污泥中并沒有發現亞硝化單胞菌屬，但是發現了與其同屬于變形菌門(Proteobacteria)的微生物，即D16與D17。對比本試驗組相同短程硝化階段的微生物分析以及污泥系統發育樹(見圖14)，結果發現兩次微生物分析均沒有得到亞硝化單胞菌屬，但均可證明污泥中有類似D16、D17的變形菌門(Proteobacteria)的微生物作為優勢菌種存在。結合反應器中的短程硝化反應，故推測D16、D17這兩種微生物可能與亞硝化單胞菌屬具有類似的功能。

圖13 短程硝化階段污泥系統發育樹Fig.13 Phylogenetic tree of partial nitrification sludge

圖14 試驗組短程硝化階段污泥系統發育樹Fig.14 Phylogenetic tree of partial nitrification sludge in experimental group

圖15為本試驗中厭氧氨氧化階段污泥系統發育樹。

圖15 厭氧氨氧化階段污泥系統發育樹Fig.15 Phylogenetic tree of Anammox sludge

由圖15可見，厭氧氨氧化中污泥階段的細菌主要為浮霉菌門(Planctomycetes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)這三類。其中，浮霉菌門(Planctomycetes)是已知的厭氧氨氧化細菌，其形態通常為卵狀，且隨著試驗的進行，代表浮霉菌門的D10條帶強度也隨之加強，故判斷其為厭氧氨氧化階段的優勢菌種。

3 結 論

(3) 微生物種群多樣性分析表明，短程硝化反應器中的優勢菌種分別與AcidobacteriaBacteria(酸桿菌)、Chlorobi(綠菌)、ProteobacteriaBacteria(變形桿菌)具有99%以上的同源性；厭氧氨氧化反應器中的優勢菌種分別與PlanctomyceteBacteria(浮霉菌)、ActinobacteriaBacteria(放線菌)、ProteobacteriaBacteria(變形桿菌)具有98%以上的同源性。