三峽水庫水域牧場鰱放流后對環(huán)境的生理適應(yīng)

英士娟，陶怡曦，胡穎雄，楊 帆，段必成，王軍紅，李 云

(1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶三峽生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，重慶 400715；2.西南大學(xué)淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；3.三峽工程魚類資源保護(hù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國三峽集團(tuán)中華鱘研究所，湖北宜昌 443100)

由于長江水利工程的建設(shè)和漁業(yè)資源的過度捕撈，長江流域野生魚類數(shù)量急劇下降[1]。為緩解漁業(yè)資源下降的趨勢，我國廣泛開展了水生生物增殖放流工作。但是人工養(yǎng)殖的魚苗或魚種投放到天然水體中，由于生存環(huán)境的改變，會導(dǎo)致魚類產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，極大地影響硬骨魚類的生理和行為[2]。應(yīng)激反應(yīng)具有兩面性，適當(dāng)應(yīng)激可以增加機(jī)體免疫力，過度應(yīng)激則會導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)超過機(jī)體自我調(diào)節(jié)閾值，打破了機(jī)體生理平衡，使機(jī)體免疫力降低甚至死亡[3-5]。因此，研究魚類放流后的生理適應(yīng)過程，對天然水域魚類資源增殖、養(yǎng)護(hù)具有重要指導(dǎo)意義。目前關(guān)于魚類增殖放流的效果評估報道主要集中在存活率和生長速率方面[6-8]，曹偵等[9]研究發(fā)現(xiàn)長江流域放流的中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)約70天時生理狀況接近放流前水平，表明水生動物對環(huán)境改變的適應(yīng)能力因種而異。

鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)是我國四大家魚之一，也是長江增殖放流最主要的魚類，在三峽庫區(qū)天然水域放流濾食性鰱，既可保護(hù)其種質(zhì)資源，又能通過食物鏈吸納營養(yǎng)鹽改善水質(zhì)[10]，因此，本研究以三峽水庫水域牧場放流鰱為實(shí)驗(yàn)對象，通過測定其放流前后肝胰臟和血清生理生化指標(biāo)變化，了解鰱放流后對環(huán)境變化的生理適應(yīng)過程，對提高鰱增殖放流效果具有指導(dǎo)作用，也可為其他魚類的增殖養(yǎng)護(hù)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料來源及樣品采集

實(shí)驗(yàn)用魚來自重慶市北碚區(qū)歇馬養(yǎng)殖場人工繁育的鰱大規(guī)格苗種。選取規(guī)格均一，健康無傷的鰱110尾，體長為(28.63±1.91)cm，體重為(440.91±82.74)g。實(shí)驗(yàn)時間為2014年10月13日至2014年12月20日。放流前0天的鰱15尾作為對照組，在養(yǎng)殖場取樣。放流地點(diǎn)為重慶市三峽生態(tài)漁業(yè)股份有限公司所屬忠縣水域牧場，該場位于甘井河與長江干流形成的河口庫灣，面積約400公頃，平均水深40 m，采用攔網(wǎng)的方式實(shí)施人工放養(yǎng)鰱、鳙魚種。為開展實(shí)驗(yàn)，在主河道建設(shè)了4個原位竹網(wǎng)箱，網(wǎng)箱規(guī)格為5 m×5 m×3 m。將110尾實(shí)驗(yàn)鰱平均放到4個網(wǎng)箱中。取樣時間為放流后第5、10、14、28、60和68天。每次取樣時測量水溫、溶解氧(DO)和pH等參數(shù)(表1)，并隨機(jī)抽取鰱15尾，取樣前用150 mg/L的MS-222麻醉實(shí)驗(yàn)魚，快速測量體長、體重，然后置于解剖盤中迅速用一次性注射器從尾部靜脈端抽取血液2 mL，4 ℃靜置2 h，凝固后3 500 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液制備血清，放置于-80 ℃冰箱保存。同時解剖取其肝胰臟組織，經(jīng)超純水清洗后置于凍存管中于-80 ℃冰箱保存。

表1 鰱樣本和采樣水體條件參數(shù)Tab.1 The parameters of samples and water

1.2 指標(biāo)測定方法

選用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定放流前后鰱肝胰臟中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性，根據(jù)試劑盒操作步驟進(jìn)行測定。選用日本奧林巴斯Au 400全自動生化分析儀測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、總膽紅素(TBIL)、總蛋白(TP)放流前后的活性或含量，根據(jù)儀器操作規(guī)范和配套試劑盒操作步驟進(jìn)行操作。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)的方式表示，用LSD檢驗(yàn)法和Dunnett’s檢驗(yàn)法進(jìn)行組間檢驗(yàn)，P<0.05則差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 放流后鰱血清乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的變化

放流后鰱血清的LDH、ALP、ALT 和AST 活性都呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(表2)。在第5天均達(dá)到最高值，且都顯著高于放流前水平。LDH、ALP、ALT 和AST 最高值分別為(752.71±102.39)、(13.75±2.31)、(45.76±2.37)、(137.52±10.98) U/L，5 d后逐漸降低，分別在第10天后達(dá)到穩(wěn)定水平。

表2 放流后鰱血清中乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶和轉(zhuǎn)氨酶活性變化Tab.2 The activity changes of LDH， ALP， ALT， AST in H. molitrix after stocking

2.2 放流后鰱血清總蛋白、甘油三酯、總膽固醇和總膽紅素的變化

放流后鰱血清中TP、TG、TC 和TBIL 都出現(xiàn)了不同程度的先升高后下降的變化(表3)。其中TP 、TG和 TBIL在第5天達(dá)到了最高值，最高值分別為(26.53±0.37) g/L、(1.21±0.06) mmol/L和(2.00±0.09) μmol/L，TC 在第10天時達(dá)到了最高值(4.54±0.11) mmol/L，顯著高于放流前水平，5 d后活性逐漸下降。68 d時TP和TBIL恢復(fù)至原水平，但TG顯著低于放流前水平，TC顯著高于放流前水平。

表3 放流后鰱血清總蛋白、甘油三酯、總膽固醇和總膽紅素的變化Tab.3 The changes of TP， TG， TC， TBIL in H. molitrix after stocking

2.3 放流后鰱肝胰臟中抗氧化酶活性變化

放流后鰱肝胰臟中SOD 和CAT 都呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，在14 d時都達(dá)到了最高值，最高值分別為(10.13±0.09)、(88.90±17.77) U/mg prot，且均顯著高于放流前水平，之后逐漸降低，其中SOD 在68 d時恢復(fù)到原有水平，CAT 在60 d時與放流前無顯著差異，但略高于放流前水平(表4)。

表4 放流后鰱肝胰臟中抗氧化酶活性變化Tab.4 The changes of SOD and CAT in H. molitrix pancreas after stocking

3 討論

3.1 放流對鰱血清乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、轉(zhuǎn)氨酶活性和總膽紅素的影響

LDH是糖代謝中催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的酶，正常條件下血清LDH含量遠(yuǎn)低于組織中LDH含量[11]。ALP主要來源于肝胰臟，可催化磷酸單酯及磷酸核苷等類似化合物水解，同時還能參與體內(nèi)蛋白質(zhì)合成和脂質(zhì)代謝等[12]，可反映機(jī)體代謝程度，是肝胰臟損傷的重要指示酶。AST和ALT是肝胰臟代謝過程中指示肝胰臟損傷的重要酶，機(jī)體正常代謝環(huán)境下只有少量轉(zhuǎn)氨酶因細(xì)胞的不斷更新、破壞而釋放到血液中，血清中含量相對較低[13]。其活性高低可以判斷肝胰臟損傷程度，常作為機(jī)體肝損傷的指標(biāo)[14]。熱應(yīng)激下虹鱒血清中AST和ALT的活性升高，由此判斷熱應(yīng)激導(dǎo)致虹鱒肝胰臟損傷[4]。肝胰臟損傷時，細(xì)胞膜的通透性加大，使組織中LDH、ALP、AST和ALT釋放到血液中，血清LDH、ALP、AST和ALT的活性短時間內(nèi)急劇升高[15]，影響機(jī)體的正常代謝活動。本研究中第5天鰱血清中LDH、ALP、AST和ALT均達(dá)到最高值，這可能是放流后受到環(huán)境因子的脅迫導(dǎo)致肝胰臟組織細(xì)胞受到損傷，影響了肝胰臟的正常生理功能，機(jī)體中脂質(zhì)過氧化物增多所致。隨時間的延長其活性逐漸回降至原水平，表明放流鰱對環(huán)境快速適應(yīng)，肝胰臟損傷得以恢復(fù)。

TBIL是二甲川膽色素屬的一種膽汁色素，血液中含有直接型和間接型兩種膽紅素，前者主要來自肝細(xì)胞中非血紅蛋白血紅素的分解，后者主要來自紅細(xì)胞破壞降解或衰老的紅細(xì)胞崩解[16]。實(shí)驗(yàn)初期鰱體內(nèi)膽紅素的含量顯著升高，可能是由于放流后生理應(yīng)激，導(dǎo)致肝細(xì)胞異常，肝功能減退，肝胰臟中間接膽紅素轉(zhuǎn)化為直接膽紅素的能力減弱，同時直接膽紅素排泄受阻，不能完全排到膽道，使得血清中膽紅素的含量升高，這與斜帶石斑魚和虹鱒溫度脅迫后的TBIL變化趨勢一致[17-18]。實(shí)驗(yàn)后期總膽紅素的含量逐漸降低至放流前水平，說明鰱的肝胰臟功能逐漸恢復(fù)。

3.2 放流對鰱血清總蛋白、甘油三酯和總膽固醇的影響

血清中的白蛋白和球蛋白合稱為TP，是組織蛋白合成的原料，反映機(jī)體蛋白代謝狀況，在魚的肝胰臟中合成，可修復(fù)機(jī)體組織，反映魚體的非特異性免疫水平的高低，還可作為能源物質(zhì)緊急供能，是衡量魚類應(yīng)激水平的指標(biāo)之一[19-20]。本研究中放流初期鰱血清TP的含量快速升高，放流后5 d達(dá)到峰值，其原因可能是放流初期對環(huán)境變化應(yīng)激反應(yīng)所致，之后顯著下降，28 d后趨于穩(wěn)定，表明放流魚類生理狀態(tài)逐漸趨于穩(wěn)定。

TG和TC是血脂的主要成分，參與機(jī)體基礎(chǔ)代謝。TG來自食物中的脂肪，肝胰臟也可以將某些糖類轉(zhuǎn)化為TG，是動物脂肪的主要成分，是被儲藏的可迅速參與生命活動的高效能源[17]，可反映機(jī)體肝代謝功能。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時，會加強(qiáng)脂肪和肌肉組織的脂肪動員和肝糖異生活動，導(dǎo)致機(jī)體游離脂肪酸和血糖水平升高[21]，實(shí)驗(yàn)中鰱血清TG的含量在放流初期升高，說明此時機(jī)體肝胰臟脂肪代謝受到顯著影響。在實(shí)驗(yàn)后期TG的含量逐漸下降并穩(wěn)定在較放流前稍低的水平，其原因一方面可能是鰱放流到天然水體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)后的回降，另一方面可能是鰱從放流前充足的人工投喂轉(zhuǎn)變到季節(jié)性水溫下降導(dǎo)致天然餌料不足而處于半饑餓狀態(tài)[22]，機(jī)體脂肪消耗減少所致。實(shí)驗(yàn)過程中放流后鰱血清10 d內(nèi)TC的含量處于持續(xù)升高狀態(tài)，可能是由于氧化應(yīng)激反應(yīng)使肝胰臟損傷導(dǎo)致膽固醇的代謝途徑受阻，代謝物質(zhì)積累。10 d后TC含量逐漸回降，表明鰱肝胰臟功能逐漸恢復(fù)。

3.3 放流對鰱肝胰臟抗氧化酶活性的影響

任何生物體中均含有一定量自由基，其中活性氧(ROS)是生物體最重要的自由基，正常代謝過程中活性氧發(fā)揮著重要的生理作用，當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，ROS的數(shù)量大量增加，打破了機(jī)體ROS代謝平衡，對脂肪、蛋白質(zhì)和核酸等造成一定的損傷[23]。肝胰臟中CAT和SOD是直接參與分解體內(nèi)ROS的主要抗氧化酶。SOD可以將O2-歧化為H2O2和O2，而CAT可以將H2O2催化分解為H2O和O2。機(jī)體內(nèi)CAT和SOD的活性變化通常說明機(jī)體內(nèi)積累了過量的ROS[24]。結(jié)果顯示，在鰱放流后，肝胰臟中SOD和CAT活性都有升高，在14 d時都達(dá)到了最高值，說明放流初期機(jī)體產(chǎn)生大量的抗氧化酶以清除體內(nèi)過量的ROS，防御過氧化損害[25]。14 d后抗氧化酶活性逐漸回降，其中SOD在68 d時恢復(fù)到原有水平，CAT活性在60 d時與放流前無顯著差異，表明放流14 d后，隨著氧自由基的清除，環(huán)境脅迫效應(yīng)逐漸減弱，鰱逐漸適應(yīng)了新的環(huán)境。

4 結(jié)論

本研究測定了人工養(yǎng)殖鰱放流至天然水體后血清和肝胰臟生理生化指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，放流初期，由于環(huán)境變化，使鰱產(chǎn)生了較強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為放流后5 d反應(yīng)肝胰臟功能的血清酶活性和代謝指標(biāo)升高，表明肝胰臟組織應(yīng)激損傷，代謝加強(qiáng)應(yīng)對應(yīng)激所需，在5～14 d后各項(xiàng)指標(biāo)逐漸下降最后恢復(fù)到放流前水平或者達(dá)成新的穩(wěn)態(tài)。另一方面肝臟組織主要的抗氧化酶活力在放流后14 d升高到峰值，抗氧化能力增強(qiáng)以消除應(yīng)激產(chǎn)生的ROS，在60～68 d接近放流前水平。放流后68 d多數(shù)指標(biāo)已達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)或達(dá)到新的平衡，表明鰱從人工養(yǎng)殖環(huán)境轉(zhuǎn)換到 d然水域至少需要68 d的生理適應(yīng)期。以上研究結(jié)果對闡明放流鰱對天然水域的生理適應(yīng)過程提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，可為深入研究鰱對環(huán)境脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制提供參考。結(jié)果提示，對魚類放流前有必要進(jìn)行野化訓(xùn)練，放流后要進(jìn)行一段時間的監(jiān)管，以便其順利地渡過環(huán)境應(yīng)激適應(yīng)期，對提高魚類的野外存活率和放流效果具有重要意義。