HBsAg陽性孕產婦IL28B基因多態性與HBV宮內感染發生風險關聯性分析

李容 張杭 黃璽鑰 杜丹

HBV感染嬰幼兒可發展為HBV攜帶者且嚴重影響嬰幼兒健康[1]。HBsAg及HBV DNA載量與新生兒宮內感染有關，降低HBV DNA載量或HBsAg水平可有效降低新生兒HBV感染率[2,3]。基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)與HCV感染等密切相關，同時還可參與機體多種疾病發生發展過程[4]。相關研究表明，白細胞介素28B(interleukin 28B，IL28B)可通過編碼干擾素λ3進而促進HCV感染自發清除[5]。本研究通過分析HBsAg陽性孕產婦IL28B rs8099917 SNP與HBV宮內感染發生風險的相關性，為預防及阻斷HBV宮內感染提供理論依據。

資料和方法

一、一般資料

選取2015年6月至2018年6月南方醫科大學第五附屬醫院收治的2000例單胎足月HBsAg陽性孕產婦為研究對象，患者年齡20～32歲，平均(28.3±9.4)歲。根據是否發生HBV宮內感染將其分為感染組(658例)與未感染組(1342例)。HBV DNA載量≥1.0×103拷貝/mL[6]。另選取同時期正常分娩孕婦542例為對照組，年齡21～30歲，平均(27.6±9.2)歲。各組孕產婦年齡、孕周等臨床資料比較均差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：孕產婦肝功能指標正常；初次妊娠；無黃疸者；臨床資料完整者。排除標準：服用抗病毒藥物；近期服用糖皮質激素類藥物者；患有子癇前期及胎兒生長受限等并發癥者；多胎妊娠；遺傳性肝病；合并其他嗜肝病毒感染者。

二、主要試劑與儀器

血液基因組DNA提取試劑盒，購于天根生物科技有限公司；Nano Drop2000c核酸檢測儀購于美國Thermo公司；TaqDNA Polymerase購自美國TaKaRa公司，ABI 377 DNA測序儀、PCR儀均購自美國ABI公司。電泳儀購于美國BIO-RAD公司，凝膠成像系統購自英國UVITEC公司。

三、HBsAg及HBV DNA載量檢測

采用熒光定量PCR檢測孕婦HBsAg及HBV DNA載量，試劑盒均購自艾康生物技術有限公司。

基因組DNA提取以及四引物擴增受阻突變體系聚合酶鏈反應(amplification refractory mutation system-PCR，ARMS-PCR) 應用DNA提取試劑盒提取全血DNA，檢測其濃度與純度，DNA樣本稀釋后，采用Sequenom軟件對IL28B rs8099917所在DNA片段進行SNP基因分型，應用Primer軟件設計IL28B rs8099917位點引物，PCR擴增、單堿基延伸引物均由美國Invitrogen公司合成；PCR反應體系共30 μL，PCR緩沖液(10×) 3 μL，位點rs8099917及T、G引物上下游各1 μL，dNTP Mix 2.4 μL，DNA樣本8 μL,TaqDNA 0.3 μL，ddH2O 12.3 μL。反應程序設定：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共35個循環，72 ℃延伸7 min。取PCR產物5 μL，瓊脂糖凝膠電泳，置于凝膠成像系統觀察結果。

IL28B rs8099917位點SNP基因型判定：野生型純合子TT型，兩條DNA條帶，252 bp、182 bp；突變雜合子TG型，三條DNA條帶，252 bp、182 bp、131 bp；突變純合子GG型，兩條DNA條帶，252 bp、131 bp。

四、觀察指標

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測各組受試者血清白細胞介素-17(IL-17)、IL-21、IL-4、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、γ干擾素(IFN-γ)水平，ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，酶標儀選購于美國BOI-RAD公司。

五、統計學方法

結 果

一、 IL28B rs8099917 SNP

IL28B rs8099917電泳結果見圖1 。IL28B 在rs8099917存在單核苷酸多態性，分別為野生型純合子TT型、突變雜合子TG型、突變純合子GG型，測序驗證準確率為100%。

圖1 IL28B rs8099917瓊脂糖凝膠電泳圖

二、Hardy-Weinberg遺傳平衡驗證

感染組、未感染組及對照組IL28B基因型頻率實際值與預測值對比，差異均無統計學意義(P>0.05)，IL28B基因型頻率穩定，符合Hardy-weinberg平衡定律，見表1。

三、IL28B基因型頻率對比

IL28B rs8099917位點基因型頻率在感染組、未感染組及對照組間分布對比，差異有統計學意義(P<0.05)，且感染組G等位基因頻率顯著高于T等位基因頻率(P<0.05)，而未感染組與對照組中G等位基因頻率與T等位基因頻率比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

四、IL28B SNP與血清指標表達的關系

觀察并分析各組IL28B rs8099917基因位點TT、TG、GG基因型與HBV宮內感染有關的血清指標的關系，結果顯示感染組TG與GG基因型患者血清IL-17、IL-21、TGF-β1、IL-4水平均顯著高于TT基因型患者(P<0.05)，而IFN-γ水平顯著降低(P<0.05)；

GG基因型患者血清IL-17、IL-21、TGF-β1、IL-4水平均顯著高于TG基因型(P<0.05)，而IFN-γ水平顯著低于TG基因型(P<0.05)。未感染組與對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表1 IL-6 rs1800796基因型頻率實際值與預測值的比較

注：a為對照組比較；b為未感染組比較；c為感染組比較

五、 IL28B SNP與HBV宮內感染發生風險的相關性

采用logistic回歸模型分析基因頻率和基因型存在顯著差異性的IL28B rs8099917位點突變基因型與HBV宮內感染發生風險的相關性，結果顯示IL28B rs8099917 GG基因型為HBV宮內感染發生的危險因素，見表4。

表2 各組IL28B rs8099917基因型頻率以及等位基因相比

表3 IL28B SNPs與血清指標表達的關系( ±s)

注：a為感染組比較；b為未感染組比較；c為對照組比較

表4 IL28B基因多態性與HBV宮內感染發生風險的Logistic分析

討 論

母嬰傳播是HBV宮內感染的主要途徑[7]，主要通過卵泡細胞將HBV傳至胚胎進而導致新生兒乙型肝炎疫苗接種失敗[8]。而孕產婦體內HBsAg陽性及HBV DNA載量過高均為HBV宮內感染的危險因素[9]。研究表明，SNP與宮頸HBV易感性密切相關，其突變基因純合子可作為預測HBV感染的重要基因型[10]。本研究主要探討HBsAg陽性孕產婦IL28B SNP與HBV宮內感染發生的相關性。

IL28B位于人19號染色體， IL28B多個SNP均與HCV感染及轉歸密切相關，但不同基因位點在HCV感染過程中表現不同[11]。IL28B rs8099917基因位點T等位基因可增加慢性乙型肝炎發展為肝硬化甚至肝癌的風險[12]。研究表明，IL28B rs8099917以TT基因型為主，而rs12979860以CC基因型為主，IL28B SNP可作為判斷慢性丙型肝炎患者抗病毒療效的重要指標[13]。IL28B rs8099917 SNP即TT型、TG型、GG型，感染組、未感染組及對照組IL28B基因型頻率穩定，均符合Hardy-weinberg平衡定律。進一步分析各組IL28B rs8099917位點基因型分布，結果顯示IL28B rs8099917位點基因型頻率在感染組、未感染組及對照組間分布差異顯著，其主要以TT基因型為主，與文獻報道相似[14]。同時本研究發現，感染組IL28B rs8099917位點G等位基因頻率顯著高于T等位基因頻率，而未感染組與對照組比較差異不顯著，說明HBsAg陽性孕產婦IL28B rs8099917位點T等位基因突變為G等位基因與HBV宮內感染有關，分析原因可能為IL28B rs8099917 SNP可通過JAK-STAT信號轉導途徑，進而影響相關基因轉錄及翻譯過程，最終引發病毒感染或發揮抗病毒清除作用[15]。提示IL28B rs8099917位點T→G導致HBV宮內感染率增加。

HBsAg陽性孕產婦發生HBV宮內感染后可引發免疫反應，CD4+T細胞會分化為輔助性T細胞(Th)Th1、Th2、Th17及調節性T細胞等，影響細胞平衡從而造成免疫系統紊亂，引起HBV宮內感染[16]。免疫失衡與IL-17及IL-21水平有關，Th17高表達可抑制調節性T細胞增殖，從而提高IL-17及IL-21水平導致免疫系統紊亂，并可引起HBV宮內感染[17]。研究發現，IL-4、TGF-β1、IFN-γ水平變化與Th1/Th2比例失衡有關，并可反映HBV宮內感染情況[18]。以上研究結果表明，血清IL-17、IL-21、IL-4、TGF-β1、IFN-γ水平與HBV宮內感染密切相關，本研究初步分析IL28B rs8099917 SNP與上述血清因子表達的相關性，結果顯示僅HBV宮內感染組GG基因型孕婦血清IL-17、IL-21、TGF-β1、IL-4水平顯著高于TG與TT基因型，而血清IFN-γ水平顯著降低，提示IL28B rs8099917位點T→G突變可引起血清IL-17、IL-21、TGF-β1、IL-4、IFN-γ水平變化，導致機體免疫系統紊亂，從而引發HBV宮內感染。同時本研究分析IL28B rs8099917 SNP與HBV宮內感染發生風險的相關性，Logistic分析顯示突變基因型GG為HBsAg陽性孕產婦發生HBV宮內感染的危險因素。本研究結果揭示HBsAg陽性孕產婦IL28B rs8099917位點T→G基因突變可增加HBV宮內感染的發生。

綜上所述，IL28B rs8099917 SNP對HBV宮內感染具有一定影響，G等位基因及GG基因型患者可增加HBV宮內感染發生風險，檢測HBsAg陽性孕產婦IL28B基因型有助于預防HBV宮內感染發生。