miR-509-3p及XIAP表達與肝癌細胞增殖侵襲能力影響

歐陽考濱 袁霞 何櫻

2013年我國肝癌死亡例數達35.81萬，占全世界因肝癌死亡人數的43.9%[1]。微小RNA(miRNA)是一類小型內源性非編碼RNA調控因子，長度為18～25個核苷酸，目前在人類基因組中發現超過1500個miRNA，其在細胞分化、細胞周期和凋亡的調控過程中發揮重要作用。miRNA的異常表達可以調節數十至數百個靶基因以協調細胞信號傳導途徑，影響下游靶基因表達，從而促進細胞增殖、侵襲和遷移等生物學過程，參與多種腫瘤的發生發展[2,3]。miR-509-3p作為腫瘤抑制因子，在膠質瘤、卵巢癌、乳腺癌、急性淋巴細胞白血病、肺癌的發展中發揮重要作用[4,5]。盡管已有較多關于肝細胞癌發生發展的分子機制研究，但miR-509-3p及其靶基因在調節肝細胞癌增殖和侵襲中的作用機制還需要進一步探討。腫瘤細胞凋亡抵抗的機制之一是其高表達凋亡抑制蛋白，該家族包括XIAP、Survivn、Livin等成員，可以通過多種機制發揮抑制凋亡的作用[6]。XIAP為X連鎖凋亡抑制蛋白，在膠質瘤研究中發現miR-509-3p具有負性調節XIAP表達的作用[4]，而在肝細胞癌中的報道較少。本研究通過觀察肝細胞癌中miR-509-3p和XIAP異常表達對肝癌細胞增殖與侵襲能力的影響，初步探索其作用機制。

材料與方法

一、一般資料

選取2013年4月至2015年4月于惠州市中心醫院經病理確診的肝細胞癌患者107例，男71例，女36例，年齡34～67歲，平均(42.1±6.5)歲。所有患者均為初次診治，手術之前未接受過化療、放療等，未合并其他惡性腫瘤。Ⅰ期21例、Ⅱ期32例、Ⅲ期38例、Ⅳ期16例。本研究經醫院倫理委員會審核通過，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

二、細胞培養及細胞轉染

于培養瓶或細胞培養皿中接種HepG2細胞，內含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃，體積分數為0.05的CO2培養箱中，當細胞密度達90%時，利用胰蛋白酶消化細胞并接種傳代。轉染前24 h，接種適當數量的細胞至6孔板中，使轉染時的細胞密度達到70%～80%。將Lipo2000室溫靜置6 min，然后分別與配好的miR-509-3p類似物、miR-509-3p抑制物及XIAPsiRNA混勻，室溫下靜置20 min，將其加入接種的6孔板中，混和后置于培養箱，6 h后加新鮮培養基，48 h后收集細胞。每組實驗至少重復3次。

三、RT-PCR檢測組織及細胞中miR-509-3p及XIAP的表達

Trizol法提取患者癌組織、癌旁組織及細胞中總RNA。以5 μL總RNA為模板，用TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒進行反轉錄，總反應體系為15 μL(cDNA 2 μL，TaqDNA聚合酶2.5 μL，上下游引物0.5 μL，雙蒸水10 μL)，反應條件如下：95 ℃ 10 s，90 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，連續40個循環。用相對Ct值分析數據，目的基因miR-509-3p mRNA的表達相對于內參基因U6的比值為2-ΔΔCt，計算miR-509-3p的相對定量表達水平。miR-509-3p正向引物序列：5′-UGAUUGGUACGUCUGUGGGUAGTT-3′，反向引物序列：5′-CUACCCACAGACGUACCAAUCATT-3′；miR-509-3p類似物正向引物序列：5′-UGAUUGGUACGUCUGUGGGUAGTT-3′，反向引物序列：5′-CUACCCACAGACGUACCAAUCATT-3′；XIAP正向序列5′-GACAGTATGCAAGATGA-GTCAAGTCA-3′，反向序列5′-GCAAAGCTTCT-CCTCTTGCAG-3′；XIAPsiRNA特異性正義鏈：5′-GUGCUGGACUCUACUACACUU-3′，反義鏈：5′-GUGUAGUAGAGUCCAGCACUU-3′；XIAPsiRNA非特異性正義鏈：5′-CUUGUAUGGGCAGAUUGC-CUU-3′,非特異性反義鏈：5′-GGCAAUCUGCCCA-UACAAGUU-3′；內參基因U6上游序列:5′-GCTT-CGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游序列:3′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5′。miR-509-3p及XIAP反轉錄引物、PCR引物和探針分別來自ABI生物公司。所有反應均在ABI實時定量PCR儀上完成，每個樣本重復3次。

四、細胞增殖及細胞侵襲力檢測

1．細胞增殖實驗：實驗過程按試劑盒說明書進行，將細胞以每孔100 μL培養基中含3000個細胞的密度接種到96孔板中，接種24、48、72、96及120 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑后1 h評估450 nm處的吸光度，以確定細胞的增殖能力。細胞增殖能力以活細胞相對于媒介物處理細胞的百分比表示，實驗至少重復3次。

2．細胞侵襲能力檢測(Transwell小室實驗)：將轉染miR-509-3p類似物的HepG2細胞及無任何處理的HepG2細胞接種到Transwell小室上室，上室每孔接種200 μL不含血清細胞懸液(2×104個)，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養基作為化學誘導劑。于培養箱中培養24 h后結晶紫染色，200倍光學顯微鏡下隨機選取10個視野，觀察穿透過濾器的被染色細胞數目，以評估細胞的侵襲和遷移能力，結果取均值，實驗至少重復3次。

五、統計學方法

結 果

一、癌組織與癌旁組織miR-509-3p與XIAP mRNA表達及癌組織中二者相關性分析

肝癌組織miR-509-3p與XIAP的相對表達量分別為0.415±0.098、1.657±0.147，癌旁組織miR-509-3p與XIAP的相對表達量分別為1.127±0.126、0.425±0.113，癌組織中miR-509-3p相對表達量較癌旁組織顯著較低(t=3.257，P=0.002)，而XIAP的相對表達量顯著較高(t=4.201,P=0.000)。肝癌組織miR-509-3p與XIAP mRNA表達水平呈負相關(r=0.218，P=0.046)，見圖1、2。

圖1 肝癌組織與癌旁組織miR-509-3p、XIAP表達比較

圖2 肝癌組織miR-509-3p與XIAP表達相關性分析

二、miR-509-3p表達對HepG2細胞增殖和侵襲能力的影響

與對照組相比，轉染miR-509-3p類似物48、72、96及120 h時，HepG2細胞增殖率明顯降低(均P<0.05)；與對照組相比，轉染miR-509-3p抑制劑48 h后HepG2細胞增殖明顯增高(均P<0.05)，見圖3。與對照組相比，轉染miR-509-3p類似物后24 h HepG2細胞侵襲數目明顯較低(分別為96.32±0.52，51.47±0.45，t=2.263,P=0.021)；與對照組相比，轉染miR-509-3p抑制劑后24 h HepG2細胞侵襲數目明顯較高(分別為94.65±0.42，120.14±0.45，t=2.463，P=0.013)。

三、siRNA沉默XIAP表達對HepG2細胞增殖和侵襲能力的影響

與陰性對照組和空白對照組相比，siRNA沉默XIAP基因表達后48、72、96和120 h，HepG2細胞增殖和侵襲能力均顯著較低(P均<0.05)。見表1。

圖3 轉染miR-509-3p類似物和抑制劑后各時間點HepG2細胞增殖率

表1 siRNA沉默XIAP表達對HepG2細胞增殖和侵襲能力影響

討 論

miRNA是近年來腫瘤研究的熱點，其可通過結合目標基因mRNA的3′非翻譯區，誘導mRNA降解或抑制mRNA翻譯發揮作用，影響細胞分化、增殖、侵襲和凋亡等過程[7,8]。多種miRNA的異常表達(上調或下調)與肝細胞癌的發生發展相關，miRNA參與多條細胞信號轉導通路的調節，如TGF-β通路、JAK/STAT信號通路傳導通路等，參與肝癌細胞增殖、凋亡、轉移等生物學過程[9-11]。有研究表明，在惡性膠質瘤、卵巢癌、胃癌等組織中均存在miR-509-3p顯著下調的現象，并且下調程度可能影響患者長期總體生存率，體外實驗中通過上調miR-509-3p的表達后，腫瘤細胞的增殖和遷移能力受到抑制，而敲除或下調miR-509-3p表達后，腫瘤細胞的增殖和遷移能力增強[12]。本研究發現，肝癌組織中miR-509-3p表達量顯著低于癌旁組織，表明肝細胞癌的發生可能與miR-509-3p的表達水平降低有關。進一步在體外細胞實驗中證實，通過轉染miR-509-3p類似物上調miR-509-3p表達后，HepG2細胞增殖和侵襲能力明顯降低，而轉染miR-509-3p抑制物下調miR-509-3p表達后，HepG2細胞增殖和侵襲能力明顯升高。本研究與Yoon等[13]報道的體外實驗的數據一致，其機制可能是miR-509-3p的過表達誘導G1細胞周期阻滯，并通過下調CDK2、Rac1及磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶催化亞基2α的表達，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。有學者在舌鱗癌的研究中發現，miR-509可調節表皮生長因子受體(EGFR)基因的表達，進而影響EGFR信號轉導通路中下游基因如p-Akt的表達發揮腫瘤抑制因子的作用[14]。

XIAP是細胞凋亡抑制因子家族中的重要成員，該家族包括XIAP、NAIP、survivin及c-IAP1等成員，由三個BIR結構域和一個環指結構域構成，它能夠通過將caspase-3和caspase-7結合到其XIAP BIR2結構域抑制caspase-3和caspase-7活性，并通過將caspase-9結合到其BIR3結構域來抑制caspase-9[15]。XIAP在乳腺癌、非小細胞型肺癌、卵巢癌等許多類型的癌癥中表達升高[16-18]。本研究中肝癌組織XIAP表達量與癌旁組織相比顯著較高。進一步通過RNA干擾的方法沉默XIAP表達，結果表明siRNA沉默XIAP基因表達后HepG2細胞增殖和侵襲能力均顯著降低。其機制可能是肝癌組織中XIAP表達增高，滅活caspase-3、7、9等關鍵半胱氨酸蛋白酶，細胞抗凋亡能力增強。XIAP還含有一個環指結構，具有泛素連接酶(E3)的活性，XIAP的E3連接酶可通過對c-Jun / AP-1的反式激活作用，上調細胞周期蛋白D1轉錄，進而影響細胞凋亡、增殖和遷移等信號級聯反應，而當下調XIAP表達時，細胞周期蛋白D1表達降低，細胞增殖減弱[19,20]。此外，XIAP通過調節CDK4/CDK6/CyclinD1復合物的表達，進而促進肝癌細胞的增殖，在用embelin(XIAP特異性抑制劑)對肝癌細胞處理后，腫瘤細胞增殖明顯受到抑制[21,22]。

miRNA通過結合靶基因的3'-UTR起作用，本研究初步探討肝癌組織中miR-509-3p表達與癌組織中的XIAP表達的相關性，結果表明miR-509-3P表達與XIAP表達呈負相關，其機制可能與miR-509-3P負性調節靶基因XIAP的表達有關[4]，與國內學者報道結果一致[23]。有研究通過熒光素酶報告實驗表明XIAPmRNA存在miR-509-3P結合位點，轉染miR-509-3P 類型物后腫瘤細胞XIAP蛋白表達明顯降低，進一步激活凋亡信號轉導等通路，細胞凋亡增多[24]。

綜上所述，與癌旁組織相比，miR-509-3p在肝癌組織樣本中表達下調，并且miR-509-3p的低表達水平可能增加肝癌細胞的增殖和侵襲能力。miR-509-3p作為一種腫瘤抑制因子，可能通過在肝癌細胞中靶向XIAP來抑制細胞增殖和侵襲，其具體作用機制有待深入研究。