轉氨酶正常或輕度增高的慢性乙型肝炎患者肝穿刺活檢病理特征

周保倉

慢性乙型肝炎是指乙型肝炎病毒(HBV)檢測為陽性，病程超過半年而伴有慢性肝炎典型臨床表現[1]。臨床上反映肝功能的轉氨酶實驗室檢查指標包括天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、ALT/AST比值、γ-谷氨酰轉肽酶等13項。研究發現轉氨酶在反映肝細胞功能方面并不具有直接的指向性意義，二者間的關系受到較多混雜因素的干擾，而病理活檢由于其準確性和特異度較好，往往是診斷各項疾病采用的金標準[2]。本研究擬選取轉氨酶正常或輕度增高的慢性乙型肝炎患者，對其進行肝穿刺活檢病理特征分析。

資料和方法

一、研究對象

選取2013年2月至2017年1月我院傳染科收治的慢性乙型肝炎患者。慢性乙型肝炎的判定標準為：(1)HBV檢測為陽性；(2)病程超過半年；(3)典型臨床表現：大部分患者可有乏力、畏食、惡心、腹脹、肝區疼痛等癥狀。轉氨酶正常或輕度增高的判定標準為：ALT水平0～65 U/L或AST水平0～60 U/L。符合以下情況當中任意一種的患者需剔除：(1)合并甲型、丙型、丁型、戊型等其他肝炎病毒重疊感染者；(2)自身免疫性肝病患者；(3)酒精性或藥物依賴性肝病患者。

二、方法

活檢穿刺設備型號為Bard51BS0672型。

經所有受試者同意行肝穿刺活檢。術前密切監測患者B超肝穿刺定位、凝血酶原時間、各項血常規值等。穿刺活檢獲得肝組織后均經福爾馬林固定、石蠟包埋、蘇木-伊紅染色進行制片；肝組織炎性壞死及纖維化程度的分期參考《病毒性肝炎防治指南(2015年版)》。同時提取患者肝組織HBV DNA。(1)去除石蠟：將石蠟包埋組織切成5～10 μm后，用滅菌小鑷子(使用前用UV照射10 min以上)將3張切片放入1.5 mL Eppendorf管中，將1 mL二甲苯(去除石蠟)加入Eppendorf管中，蓋好蓋子，漩渦振蕩10 s，4 000 r/min室溫離心2 min，去上清，然后添加1 mL無水乙醇(去除二甲苯)，漩渦振蕩混勻，14 000 r/min，室溫離心2 min，棄上清，打開蓋子，在室溫最高至37 ℃時孵育10 min，直至無乙醇殘留。(2)裂解：加入180 μL BufferGTL，使以上沉淀重懸，加入20 μL ProteinaseK，漩渦振蕩混勻，56 ℃消化過夜，使組織徹底消化，在一定程度上可提高DNA產量。樣本通過蛋白酶K消化，在變形條件下裂解。(3)加熱：在70 ℃下孵育1 h，逆轉福爾馬林交聯。短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底，將以上溶液注入到吸附柱上，蓋好管蓋，8 000 r/min離心1 min，棄上清。(4)結合：小心打開管蓋，向吸附柱中加入550 μL Buffer GW2(使用前添加無水乙醇)，蓋好管蓋，8 000 r/min，離心1 min棄上清，再14 000 r/min離心3 min，將DNA結合到硅膠膜上，雜質不結合。(5)洗滌：將75 μL Buffer GE溶液加入吸附柱膜中，室溫放置5 min，14 000 r/min離心1 min，再重復以上步驟1次，將殘留的污染物洗掉，收集DNA溶液。(6)提取：所得液體即為DNA樣品，分裝于干凈消毒的1.5 mL Eppendorf，-20 ℃凍存保存。HBV DNA的提取等工作由北京貝瑞和康生物技術有限公司完成。

三、統計學處理

采用率、構成比、相對比、均數、中位數、標準差對結果進行統計學描述。計量資料服從正態分布，采用兩獨立樣本t檢驗或F檢驗進行比較；不服從正態分布，采用兩獨立或多組樣本秩和檢驗進行比較。采用χ2檢驗、Fisher確切概率法及Spearman等級相關對病理學分級、分期與HBV DNA水平等資料的關聯性進行分析。無特殊說明情況下顯著性水平α=0.05，所有P值表示雙側概率。

結 果

一、受試者一般資料

本研究共收集到慢性乙型肝炎患者152例，患者平均年齡(35.90±7.55)歲，其中男性86例(56.58%)，HBsAg(+)患者96例(63.16%)，HBeAg(+)患者26例(17.11%)，抗Hbc(+)患者18例(11.84%)，初中及以下文化水平的患者57例(37.50%)，有家族史的患者25例(16.45%)，有高危性生活史的患者41例(26.97%)，有輸血史的患者22例(14.47%)，有創傷性美容史的患者35例(23.03%)，有手術史的患者76例(50.00%)。

二、慢性乙型肝炎患者炎癥分期影響因素的單因素分析

采用χ2檢驗、Fisher確切概率法對不同分類群體中慢性乙型肝炎患者炎癥各分期人數構成比進行比較。結果顯示，性別、年齡、是否HBsAg陽性、是否HBeAg陽性、是否抗HBc陽性、家族史、創傷性美容史、手術史、輸血史及高危性生活史是慢性乙型肝炎患者炎癥分期的影響因素(均P<0.05)。結果見表1。

表1 慢性乙型肝炎患者炎癥分期影響因素的單因素分析(n=152)

注：*表示差異有統計學意義(P<0.05)

三、慢性乙型肝炎患者纖維化分期影響因素的單因素分析

對不同分類群體中慢性乙型肝炎患者纖維化各分期人數構成比進行比較，結果顯示，性別、年齡、是否HBsAg陽性、是否HBeAg陽性、家族史、創傷性美容史、手術史、輸血史及高危性生活史是慢性乙型肝炎患者纖維化分期的影響因素(均P<0.05)。結果見表2。

四、慢性乙型肝炎患者HBV DNA定量影響因素的單因素分析

既往研究報道，由于DNA定量測定結果本身不具有較好的正態分布性，但可經對數轉換使其近似服從正態分布(P>0.05)，故此處先對原始定量結果取對數后進行單因素分析。若經轉換后仍不服從正態分布則采用兩獨立或多組樣本秩和檢驗進行單因素分析。結果顯示，年齡、是否HBsAg陽性、是否HBeAg陽性、家族史、創傷性美容史、手術史、輸血史及高危性生活史是慢性乙型肝炎患者HBV DNA定量的影響因素(均P<0.05)。結果見表3。

表2 慢性乙型肝炎患者纖維化分期影響因素的單因素分析(n=152)

注：*表示差異有統計學意義(P<0.05)

五、慢性乙型肝炎患者HBV DNA定量水平與其病理特征的相關性

采用Spearman等級相關對病理學分級、分期與HBV DNA水平等級(取所有HBV DNA定量水平對數后，以其中位數作為閾值將HBV DNA水平分為高低兩水平)資料的關聯性進行分析。結果顯示，HBV DNA水平等級與炎癥等級呈正相關且相關系數差異有統計學意義(rs=0.314，P<0.05)，而與纖維化等級的相關系數差異無統計學意義(rs=0.178，P>0.05)。

表3 慢性乙型肝炎患者HBV DNA定量影響因素的單因素分析(n=152)

注：*表示差異有統計學意義(P<0.05)

討 論

有研究表明，慢性乙型肝炎患者肝臟病理炎癥分級、外周微循環變化以及纖維化程度分期密切相關，而目前肝穿刺組織活檢仍然是判定慢性肝炎炎癥、纖維化程度的金標準[3]。ALT主要存在于肝細胞漿內，1%的肝細胞發生損傷后就能使血清ALT濃度增高1倍；因此，ALT可以作為肝功能損害的評價指標之一，其輕度升高可以作為疾病進展的重要標志[4]。研究表明，ALT越高，肝炎疾病及纖維化的進展發生率就越高，但是如果免疫反應僅引起炎癥和纖維化，未損傷肝細胞，肝細胞漿內的酶未釋放入血，血清轉氨酶可不升高[5]。

本研究年齡、是否HBsAg陽性等一系列因素均與炎癥及纖維化病變存在關聯。其原因可能是乙型肝炎患者可以通過不同的途徑感染乙肝引起病理學變化，且創傷性美容史、手術史、輸血史等均能夠直接誘發外源性感染，最終造成肝臟炎癥甚至纖維化的發生[6]。病理學分級、分期與HBV DNA水平等級進行相關性分析時也發現，HBV DNA水平等級與炎癥等級呈正相關。其原因可能是機體感染的時間延長，病毒在體內的拷貝數呈現指數級增長，繼而導致免疫復合物急性沉著在肝組織導致栓塞形成，引起急性肝壞死而導致死亡，從而誘發炎癥病理反應[7]。本研究還發現，HBV DNA水平等級與纖維化等級不具有相關性。其可能是因為機體代償能力不足以應付病變速度的結果，通常只有在疾病進展到不可逆的階段才發生。轉氨酶正常或輕度增高的慢性乙型肝炎患者及時并且全程接受抗病毒治療，HBV DNA水平還是可以及時得到控制，病情逆轉的概率很大，因此二者的相關性可能不是很明顯[8]。