重組禽流感（H5+H7）二價滅活苗免疫抗體監測與分析

郁再洛 羅強

（廣西凌云縣動物疫病預防控制中心 533199）

禽流感(Avian Influenza,AI),主要由正黏病毒科的A型流感病毒所引起的傳染病，流行范圍廣，傳播速度快，病死率高，亞型多，變異快，其中H5和H7亞型對養禽業和人類身體健康危害嚴重，被世界動物衛生組織（OIE）列入A類動物疫病，我國列為一類動物傳染病[1]。凌云縣地處廣西西北部，云貴高原東南邊緣地帶，北連樂業縣，西接田林縣，東臨河池市的鳳山、巴馬兩縣，南靠右江區。總面積2053平方公里，其中40%為喀斯特山區。由于特殊的地理位置，動物防疫基礎設施薄弱，防疫力量不足，活禽及產品流通頻繁，導致禽流感疫情風險加大，2017年發生人際間感染H7N9流感，發病3人，死亡2人，禽流感防控的形勢異常嚴峻。近年來，凌云縣把免疫工作作為防控禽流感的主要措施來抓，廣泛開展禽流感免疫血清學抗體監測，旨在對免疫工作進行客觀評估，為科學指導防控工作提供依據。

1 材料及方法

1.1 樣品來源

2018年春秋季集中免疫結束后，隨機抽全縣8個鄉鎮44個養禽場和172個農村散養戶的健康家禽，共采樣831份，其中養殖場440份，占52.94%，水禽樣品226份，占31.52%。采樣家禽經過重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗首免或二次免疫，疫苗來自政府統一采購的肇慶大華農生物藥品有限公司（批號01721164）、乾元浩生物股份有限公司（批號2018099）、青島易邦生物工程有限公司（批號182364500）。疫苗免疫接種方法及劑量按相關產品說明書規定操作。

1.2 試劑

哈爾濱維科生物技術開發公司生產的禽流感H5亞型（Re-8株）血凝抑制試驗抗原，批號2018001、2018007；禽流感H7亞型（H7N9株）血凝抑制試驗抗原，批號2017012、2018007。

1.3 檢測儀器

單道、多道移液器，微量振蕩器，96孔V型血疑板，離心機等。

2 檢測方法及判斷標準

參照國標《高致病性禽流感診斷技術》 （GB/T 18936-2003）標準，通過血凝（HA）和血凝抑制試驗（HI）的方法檢測H5、H7亞型抗體。以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數作為HI滴度。HI效價≥4log2判斷為合格，群體合格率達70%以上達標。

3 結果及分析

3.1 抗體合格情況

檢測結果顯示，禽流感H5亞型和H7亞型抗體總體合格率分別為83.27%、87.97%，二者的抗體效價差距不大，但H7亞型優于H5亞型。養殖場和農村散養禽流感H5、H7亞型抗體合格率分別為81.36%、85.42%和85.42%、90.79%，養殖場的抗體合格率比較散養戶略低。雞禽流感H5、H7亞型抗體合格率分別為85.45%、90.79%，水禽禽流感H5、H7亞型抗體合格率分別為79.38%、83.2%，說明雞的禽流感H5、H7亞型抗體合格率比水禽高。詳見表1。

表1 禽流感H5、H7亞型抗體檢測情況（單位：份、%）

表2 禽流感H5、H7亞型一免、二免抗體檢測情況表（單位：份、%）

附圖 禽流感H5、H7亞型抗體滴度分布

3.2 抗體滴度分布情況

試驗結果表明，所檢的831個樣品中H5亞型有770份樣品檢測出抗體，占92.65%，H7亞型有782份樣品檢測出抗體，占94.1%。HI效價≥4log2以上的分別占83.27%、87.97%，且維持在較高的抗體水平狀態，群體合格率達到農業農村部70%以上的規定要求，詳見附圖。

3.3 禽流感H5、H7亞型一免、二免抗體檢測情況

查閱免疫檔案記載，所檢樣品中有337個樣品是經過二次免疫后采集，其H5亞型和H7亞型抗體檢測合格率分別為87.83%、91.39%，通過一免禽流感H5亞型和H7亞型抗體合格率分別為80.16%、85.63%，由此可見，經過二免后的雞或水禽其抗體水平均比一免高，詳見表2

4 小結與討論

（1）從監測結果來看，2018年凌云縣禽流感H5、H7亞型免疫抗體合格率都比較高，免疫應答顯著，臨床觀察接種后副反應小，群體合格率均超過國家規定標準，說明重組禽流感病毒(H5+H7)二價滅活苗免疫原性良好，安全有效，該苗的推廣使用避免了單苗注射，降低了成本，減少家禽應激次數，實現一次免疫同時防控H5和H7兩種亞型禽流感流行毒株的目的，對防控禽流感提供有效的免疫保護作用[2]。

（2）在檢測結果表明，不同免疫程序、不同飼養方式、不同禽類別其抗體效價有差異。凌云縣規模養殖場的抗體合格率略低于散養戶的主要原因是部分養殖場由場主自行開展，沒有配備專業技術人員，沒有按免疫程序開展二免，加上飼養管理水平欠缺，環境條件差易導致家禽營養不良，影響免疫應答。而散養戶家禽雖然免疫密度相對較低，但免疫由鄉鎮動物防疫合作社統一進行，技術相對成熟，且部分血清又來自于動物防疫示范村，按示范要求均進行了二免。同時筆者注意到，由于春秋兩防的檢測結果作為年度績效考評的依據，一些防疫員企圖通過隨意加大注射劑量和免疫次數來提高抗體合格率，相反造成免疫抑制或麻痹，其抗體水平不一定很理想。此外，凌云縣散養戶及養禽場的飼養周期均超100d，只是在春秋季集中進行禽流感免疫，不能按規定的日齡計劃免疫，對禽流感的免疫效價和保護作用有一定的影響。

（3）本次監測的樣品主要采集來自春秋兩防后的家禽，樣品的來源有一定的局限性，數量也相對較少，不一定完全反映抗體水平。監測中對不同季節、不同日齡禽類、蛋禽、種禽的流感抗體水平情況，還得不到全面的掌握和了解。檢測方法僅采用血凝和血凝抑制（HA-HI），沒能采用禽流感病毒間接ELISA抗體檢測方法進行定性分析，相互印證和參考。

（4）在檢測過程中，實驗室環境溫度濕度，抗原的標定，紅細胞的來源及濃度，血凝反應板的光潔度，抗原與抗體、紅細胞的作用時間，待檢血清、抗原、BPS液的污染程度、凍溶次數及操作人員的熟練程度等很多因素對血凝抑制試驗（HI）的結果有一定影響[3]，從而導致漏判或誤判。實驗中對4單位病毒配比比例準確性至關重要，每次試驗一定要對4單位抗原進行凝集性回歸試驗，確保檢測的準確性。試驗中筆者經常遇到出現2～3孔有凝集現象而影響判斷，需要除去存在血清中的非特異凝集素，方法是在56℃水浴30min，加入同體積的1%雞紅細胞，混勻，室溫靜置30min，1500r/min離心8min后取上層血清進行檢測，判斷結果時增加一個HI滴度。也有報道稱，采用待檢血清同種家禽的紅細胞，減少非特異凝集，有待于論證和探討。

5 提高禽流感免疫效果的主要技術措施

5.1 制定切實可行的免疫程序

根據檢測結果、禽病的流行特點和飼養管理水平制定合理的免疫程序，生長期超過70d的肉雞場實行兩次免疫，15～20日齡進行第一次基礎免疫，間隔3周后再進行一次加強免疫。農村散養家禽實施集中免疫，對超免疫期或新補欄家禽及時補免。

5.2 規范免疫技術操作

免疫時做到操作規范、程序合理、部位準確、劑量充足、安全保定、消毒規范。實施免疫前了解畜禽健康狀態，對器械嚴格消毒，疫苗必須在2～8℃的條件下保存、運輸，使用前進行預溫，油乳劑要充分搖勻，疫苗使用時最好1h用完。

5.3 加強畜禽的飼養管理

在對家禽免疫接種時要加強對畜禽的飼養管理，保持欄舍干凈衛生，通風良好，均衡飼料營養，投喂黃芪多糖、電解多維等提高家禽的免疫應答，減少應激，免疫前后盡量不使用含抗生素、磺胺類的藥物和飼料。

5.4 強化家禽免疫監測效果評估工作

定期對散養戶、養殖場采取集中監測、常規監測和隨機檢測相結合的辦法，開展家禽免疫抗體效價評估，總結免疫中存在的問題和不足，提出整改措施，對未達到免疫抗體保護水平的應及時補免。

5.5 提高防疫隊伍業務素質

禽流感免疫技術性強，涉及面廣，工作難度大。在免疫工作開展前，要組織開展形式多樣的宣傳、技術培訓和指導，提高防疫隊伍業務素質和養殖者的防疫意識，規范免疫操作，落實免疫檔案制度，確保免疫工作可追溯，全面提高防疫密度和防疫質量，建立穩固的免疫屏障，從而有效地控制禽流感疫情的發生。