煙葉鉀含量種質(zhì)間差異分析及其田間鑒定指標(biāo)篩選

馬柱文，張振臣，袁清華，屈玉嬌，李集勤，李淑玲，陳俊標(biāo)

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】鉀含量是評(píng)價(jià)煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，對(duì)煙葉成熟度、燃燒性及香氣吃味均有影響，在優(yōu)質(zhì)煙草品種選育過(guò)程中起著重要指導(dǎo)作用［1-3］。但育種過(guò)程難以實(shí)現(xiàn)對(duì)大量種質(zhì)及后代株系的煙葉鉀含量進(jìn)行逐一測(cè)定［4］，導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)種質(zhì)及株系（特別是高鉀種質(zhì)及株系）易被遺漏，影響高鉀種質(zhì)及株系篩選效果。因此，了解高鉀煙草種質(zhì)形態(tài)特征，合理評(píng)價(jià)高鉀煙草種質(zhì)以及確定鉀含量的田間鑒定指標(biāo)，對(duì)篩選高鉀種質(zhì)資源、選育優(yōu)質(zhì)煙草品種（特別是高鉀品種）具有重要指導(dǎo)意義。【前人研究進(jìn)展】越來(lái)越多研究者結(jié)合聚類(lèi)分析、主成分分析、因子分析和多元逐步回歸分析等多指標(biāo)綜合分析方法直觀、快速判斷作物的品質(zhì)優(yōu)劣［5-6］及抗逆強(qiáng)弱［7-8］。在作物鉀含量多指標(biāo)綜合評(píng)定研究中，唐忠厚等［9］以31份不同類(lèi)型優(yōu)質(zhì)甘薯品種（系）為材料，確定塊根鉀利用效率與鉀敏感性可作為篩選鉀高效甘薯品種的兩個(gè)主要指標(biāo)；閻洪奎等［10］認(rèn)為玉米苗期葉片癥狀指數(shù)與穗粒重低鉀脅迫指數(shù)具有極其顯著的相關(guān)性，采用苗期葉片癥狀指數(shù)作為耐低鉀鑒定指標(biāo),具有快速鑒定、早期篩選、

省工省時(shí)、節(jié)約試驗(yàn)用地等優(yōu)點(diǎn)；楊佳蒴等［11］發(fā)現(xiàn)棉花苗期葉片蔗糖代謝、葉綠素含量和單株葉片生物量3項(xiàng)指標(biāo)對(duì)棉花最終的鉀含量具有較好的預(yù)測(cè)效果。【本研究切入點(diǎn)】傳統(tǒng)的研究方法主要是通過(guò)線性回歸建立的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎谏婕耙蛩剌^多，參數(shù)選取較為困難，預(yù)測(cè)結(jié)果差異也較大。目前，煙葉鉀含量與化學(xué)成分、形態(tài)特征的相關(guān)分析已有涉及［12-13］，而采用多指標(biāo)綜合分析方法的研究則較少報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】嘗試采用多元多指標(biāo)分析方法，以形態(tài)特征為評(píng)價(jià)因子，結(jié)合聚類(lèi)分析、主成分分析、因子分析和多元逐步回歸分析方法, 篩選煙葉鉀含量的田間鑒定最優(yōu)指標(biāo)，旨在為加速高鉀種質(zhì)資源初篩、挖掘及優(yōu)質(zhì)煙草品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地進(jìn)行。供試的31份煙草材料均來(lái)自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，其中烤煙13份，曬煙18份（表1）。

表1 供試煙草種質(zhì)及類(lèi)型Table 1 Types and germplasms of the tested tobacco

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)按調(diào)制類(lèi)型分區(qū)，設(shè)烤煙區(qū)和曬煙區(qū)，不同調(diào)制類(lèi)型間及試驗(yàn)區(qū)周邊分別設(shè)保護(hù)行。各類(lèi)型間及同一類(lèi)型內(nèi)隨機(jī)排列，單行植，行距1.2 m，株距0.5 m，3次重復(fù)，每小區(qū)植煙32株。

采用點(diǎn)穴方式播種，淺水育苗。采用精準(zhǔn)鑒定方法，2016年1月5日播種，3月15日移栽；2017年1月7日播種，3月14日移栽。移栽后，結(jié)合小培土和大培土進(jìn)行施肥，每667 m2施純氮6.5 kg，氮磷鉀比例1∶1∶2，田間管理措施與優(yōu)質(zhì)煙大田生產(chǎn)相同。土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分：pH 6.04、有機(jī)質(zhì)含量18.8 g/kg、堿解氮含量93.2 mg/kg、有效磷含量72.4 mg/kg、速效鉀含量95.6 mg/kg、緩效鉀含量169 mg/kg。

1.3 調(diào)查項(xiàng)目及方法

形態(tài)特征調(diào)查記載：每一重復(fù)選緊鄰5株正常生長(zhǎng)的煙株，依據(jù)《煙草種植資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》調(diào)查形態(tài)學(xué)特征：株高（x1）、莖圍（x2）、節(jié)距（x3）、葉數(shù)（x4）、最大葉長(zhǎng)（x5）、最大葉寬（x6）、主側(cè)脈夾角（x7）、莖葉夾角（x8）、花冠長(zhǎng)度（x9）、花冠直徑（x10）、花萼長(zhǎng)度（x11）［14］，計(jì)算兩年平均值。

煙葉K2O含量測(cè)定：每一重復(fù)選緊鄰5株正常生長(zhǎng)的煙株，抽蕾打頂，每株成熟采收中部葉、上二棚葉片各3片，馬上進(jìn)行105℃殺青，然后曬干、混合粉碎，采用5%的乙酸提取，3次重復(fù)，K-Na火焰光度計(jì)測(cè)定鉀含量［15］，計(jì)算平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行整理與分析；采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析、聚類(lèi)分析、主成分分析及多元逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單項(xiàng)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)描述

參試31份煙草種質(zhì)的鉀含量及形態(tài)特征存在豐富的遺傳多樣性，從表2可以看出，鉀含量介于 13.50～47.50 mg/g，均值為 29.00（±7.60）mg/g，變異系數(shù)為26.10%。形態(tài)特征變異系數(shù)介于7.08%～32.61%，以莖葉夾角（32.61%）最大，莖圍（7.08%）最小。

表2 供試煙草種質(zhì)單項(xiàng)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)描述Table 2 Statistical description of single index of the tested tobacco germplasms

圖1 31份煙草種質(zhì)聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.1 The dendrogram of the 31 tobacco germplasm

2.2 煙草種質(zhì)聚類(lèi)分析

采用歐式距離離差平方和法（UPGMA）對(duì)鉀含量進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖1），可將31份煙草種質(zhì)劃分為3類(lèi)：貝爾93、春雷三號(hào)、大白尖0929、大白筋599、大虎耳、大埔煙、庫(kù)扎加E2、K326、封開(kāi)11、81-26為第一類(lèi)，為高鉀種質(zhì)；春雷五號(hào)、大山溝、大葉煙、鶴山二號(hào)-2、牛津26、大同、谷咀、海南6-2、鶴山中南、黑葉一號(hào)、五十葉、騰沖大柳葉、萬(wàn)年煙、細(xì)種秋根、云羅06-1、云羅04-1、小花青、奀種牛利為第二類(lèi)，為中鉀種質(zhì)；古蠶黑葉、黑葉二號(hào)、云羅03為第三類(lèi)，是低鉀種質(zhì)。

根據(jù)鉀含量聚類(lèi)分析的結(jié)果，將3類(lèi)煙草種質(zhì)的各主要性狀計(jì)算平均值（表3），比較不同含鉀類(lèi)型種質(zhì)的形態(tài)特征：

第一類(lèi)（高鉀種質(zhì)）：植株高，莖圍粗，節(jié)距疏，葉數(shù)較多，腰葉長(zhǎng)，葉面寬，主側(cè)面夾角較大，莖葉夾角小，花冠長(zhǎng)，花冠直徑大，花萼長(zhǎng)。

第二類(lèi)（中鉀種質(zhì)）：植株較高，莖圍粗，節(jié)距較疏，葉數(shù)多，腰葉較長(zhǎng)，葉面較寬，主側(cè)面夾角小，莖葉夾角較大，花冠較長(zhǎng)，花冠直徑較大，花萼較長(zhǎng)。

第三類(lèi)（低鉀種質(zhì)）：植株矮小，莖圍細(xì)，節(jié)距密，葉數(shù)少，腰葉短，葉面窄，主側(cè)面夾角大，莖葉夾角大，花冠短，花冠直徑小，花萼短。

表3 不同鉀含量類(lèi)型的形態(tài)特征比較Table 3 Comparison of morphological characteristics among different types of potassium

2.3 煙草形態(tài)特征相關(guān)分析及共線性診斷

鉀含量與形態(tài)特征的相關(guān)分析表明，葉長(zhǎng)、花冠直徑與鉀含量呈極顯著正相關(guān)，花冠長(zhǎng)度呈顯著正相關(guān)。其中，最大葉長(zhǎng)（r=0.683**）、花冠直徑（r=0.651**）的相關(guān)系數(shù)較大，表現(xiàn)極顯著正相關(guān)；花冠長(zhǎng)度（r=0.363*）表現(xiàn)顯著正相關(guān)；最大葉寬（r=0.347）、花萼長(zhǎng)度（r=0.264）、莖圍（r=0.189）、株高（r=0.135）、節(jié)距（r=0.108）、葉數(shù)（r=0.024）、莖葉夾角（r=-0.255）、主側(cè)脈夾角（r=-0.003）的相關(guān)系數(shù)較小，表現(xiàn)弱相關(guān)性。由于各形態(tài)特征單項(xiàng)指標(biāo)之間存在或多或少的相關(guān)性，以至于導(dǎo)致其提供的信息發(fā)生重疊，需在此基礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)的多元線性回歸分析。

對(duì)形態(tài)特征自變量觀測(cè)數(shù)據(jù)構(gòu)成的矩陣進(jìn)行共線性診斷（表4），容差均大于0.1，方差膨脹因子（VIF）均小于10，說(shuō)明變量之間并不存在嚴(yán)重的共線性，所反映的信息不發(fā)生較大重疊，可利用篩選可靠的評(píng)價(jià)指標(biāo)。多元回歸方程假設(shè)檢驗(yàn)P=0.008，說(shuō)明回歸模型極顯著，認(rèn)為部分形態(tài)特征對(duì)鉀含量的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。葉長(zhǎng)和花冠直徑兩個(gè)自變量對(duì)鉀含量均達(dá)到顯著水平，而其他自變量對(duì)鉀含量的作用均不顯著，這與相關(guān)分析結(jié)果一致。

2.4 煙草各形態(tài)特征主成分分析

對(duì)各形態(tài)特征進(jìn)行主成分分析，將原來(lái)具有相關(guān)性的形態(tài)特征單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成幾個(gè)新的且彼此獨(dú)立的主成分指標(biāo)。從表5可以看出，主成分分析特征值中5個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到84.624%，可以概括不同形態(tài)特征的大部分信息,可用這5個(gè)主成分指標(biāo)對(duì)鉀含量進(jìn)行概括分析。

決定第一主成分大小的主要是最大葉長(zhǎng)（0.718）、最大葉寬（0.726）、花冠長(zhǎng)度（0.852）、花冠直徑（0.732）和花萼長(zhǎng)度（0.715）5個(gè)原始性狀，可反映原始數(shù)據(jù)信息量的33.137%。

決定第二主成分大小的主要是株高（0.657）、莖圍（0.660）和葉數(shù)（0.873）3個(gè)原始性狀，可反映原始數(shù)據(jù)信息量的22.064%。

表4 多元線性回歸參數(shù)估計(jì)及共線性統(tǒng)計(jì)Table 4 Multiple linear regression equation parameter estimate and collinearity statistics

表5 煙草各種各形態(tài)特征主成分的特征向量及貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvectors and contribution rate of principal morphological characteristic components of the tobacco

決定第三主成分大小的主要是莖圍（0.519）、葉寬（0.483）、莖葉夾角（0.410）和花萼長(zhǎng)度（-0.514）4個(gè)原始性狀，可反映原始數(shù)據(jù)信息量的11.547%。

決定第四主成分大小的主要是節(jié)距（0.501）、主側(cè)脈夾角（-0.462）和莖葉夾角（0.595）3個(gè)原始性狀，可反映原始數(shù)據(jù)信息量的9.679%。

決定第五主成分大小的主要是葉長(zhǎng)（0.489）和花冠直徑（0.465）2個(gè)原始性狀，可反映原始數(shù)據(jù)信息量的8.197%。

表6 煙葉鉀含量相關(guān)指標(biāo)的主成分分析中特征根及特征變量Table 6 Eigenvalues and eigenvectors in PCA of correlated traits with the potassium content of tobacco leaves

2.5 逐步回歸分析

以5個(gè)主成分的特征向量為自變量，鉀含量為因變量進(jìn)行主成分回歸分析，主成分回歸方程的假設(shè)檢驗(yàn)P=0.001，說(shuō)明主成分回歸模型極顯著（表6），可以認(rèn)為形態(tài)特征的主成分對(duì)鉀含量的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

經(jīng)過(guò)主成分逐步回歸分析，第一主成分（PC1）與第五主成分（PC5）對(duì)因變量的作用極顯著，擬合回歸方程：y=0.533PC1+0.461PC5。得到以11個(gè)形態(tài)特征為自變量，鉀含量為因變量的一般多元線性回歸方程：y=0.014x1+0.190x2+0.142x3-0.066x4+0.608x5+0.442x6+0.122x7-0.009x8+0.360x9+0.604x10+0.302x11。

根據(jù)相關(guān)分析、多元線性回歸方程的結(jié)果可知，最大葉長(zhǎng)與花冠直徑對(duì)鉀含量信息存在極顯著的反映能力。以最大葉長(zhǎng)（x5）和花冠直徑（x10）為自變量，以鉀含量為因變量，再次進(jìn)行回歸分析（表7）。回歸方程假設(shè)檢驗(yàn)P＜0.001，說(shuō)明回歸模型極顯著，回歸方程擬合度好。擬合回歸方 程y=-1.699+0.041x5+0.831x10（R2=0.9602），估計(jì)精度在89.66%以上。常量、葉長(zhǎng)和花冠直徑的假設(shè)檢驗(yàn)均達(dá)顯著水平，較好證明葉長(zhǎng)、花冠直徑對(duì)鉀含量信息有極顯著的反映能力。

3 討論

煙草是喜鉀作物，影響煙葉鉀含量的因素很多，主要包括品種類(lèi)型［16］、鉀肥類(lèi)型［17］、土壤環(huán)境［18］、施鉀方式［19］、調(diào)控措施［20］以及氣候條件［21］等。田間直觀指標(biāo)篩選，孤立的使用某一單項(xiàng)指標(biāo)很難較準(zhǔn)確反映煙葉鉀含量的信息，而選擇的評(píng)價(jià)指標(biāo)間也存有一定的相關(guān)性，導(dǎo)致反映信息的交叉重疊。因此，多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)過(guò)程有必要對(duì)指標(biāo)間進(jìn)行共線性診斷，以確立可靠的指標(biāo)篩選。品種類(lèi)型是影響煙葉鉀含量主要的內(nèi)在因素［22］，參試的31份煙草種質(zhì)的煙葉鉀含量存有較大差異，變異系數(shù)達(dá)26.10%，貝爾93（47.5 mg/g）、春雷三號(hào)（43.1 mg/g）鉀含量均大于40.0 mg/g，可作為高鉀種質(zhì)資源利用。通過(guò)聚類(lèi)分析，將參試煙草種質(zhì)劃分為高鉀種質(zhì)、中鉀種質(zhì)和低鉀種質(zhì)3種類(lèi)型。

主成分分析將11個(gè)形態(tài)特征指標(biāo)轉(zhuǎn)換成5個(gè)彼此獨(dú)立的綜合指標(biāo)，其特征值中5個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到84.624%，可以概括不同形態(tài)特征的大部分信息。第一主成分反映原始數(shù)據(jù)信息量的33.137%，主要是最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、花冠長(zhǎng)度、花冠直徑和花萼長(zhǎng)度5個(gè)原始性狀組成。可以看出，花、葉的形態(tài)特征對(duì)品種間差異信息的反映能力較強(qiáng)。

通過(guò)逐步回歸分析，篩選出顯著反映煙葉鉀含量的葉長(zhǎng)（x5）和花冠直徑（x10）兩個(gè)形態(tài)特征指標(biāo)，擬合煙葉鉀含量的評(píng)價(jià)回歸模型y=-1.699+0.041x5+0.831x10（R2=0.9602）， 估計(jì)精度在89.66%以上。最大葉長(zhǎng)與煙葉鉀含量具有顯著相關(guān)，這與舒海燕［12］、張勝［13］等研究結(jié)果相似；而花的形態(tài)特征與煙葉鉀含量的相關(guān)分析報(bào)道甚少，鉀素在根系與地上部間較快速流動(dòng)，基于源庫(kù)關(guān)系，花形態(tài)建成能提供由根系向地上部運(yùn)輸?shù)膭?dòng)力，有助于體內(nèi)鉀素積累。現(xiàn)蕾打頂是烤煙生產(chǎn)中重要的農(nóng)藝措施，鄭憲濱等［23］發(fā)現(xiàn)，打頂后10 d內(nèi)，煙株體內(nèi)有大量的鉀離子沿韌皮部回流到根中，回流鉀量占根系向地上部的鉀量的比例大約在50%以上。

4 結(jié)論

將31份煙草種質(zhì)聚類(lèi)分成10份高鉀種質(zhì)、18份中鉀種質(zhì)、3份低鉀種質(zhì)。高鉀種質(zhì)的形態(tài)特征表現(xiàn)為高植株，粗莖圍，節(jié)距疏，較多葉數(shù)，腰葉長(zhǎng)，腰葉寬，主側(cè)面夾角較大，莖葉夾角小，花冠長(zhǎng)，花冠直徑大，花萼長(zhǎng)。腰葉葉長(zhǎng)及花冠直徑對(duì)煙葉鉀含量信息有極顯著的反映能力，可作為煙葉鉀含量的田間鑒定指標(biāo)。