大頂苦瓜組培苗試管外微嫁接技術研究

吳 蓓，張木清，鄭巖松，戴修純

（廣州市農業科學研究院，廣東 廣州 510335）

【研究意義】大頂苦瓜（Momordica charantiaLinn.）為葫蘆科苦瓜屬1年生草本蔓生蔬菜，是廣東省的著名蔬菜品種，具有個大、肉厚、皮色翠綠、口感脆嫩的特點，并具較高的營養價值和藥用功效［1］，長期以來暢銷我國華南地區并遠銷東南亞國家。隨著大頂苦瓜被越來越多的消費者接受，其種植面積日益加大，但存在嚴重的重茬連作問題引發各種蔬菜疫病如苦瓜枯萎病等土傳病害的暴發。傳統的苦瓜嫁接栽培技術利用砧木良好的抗病性等特點，已大大降低了苦瓜栽培時的死亡率，但依舊存在生產成本過高、生長周期長、費用高等缺點。微嫁接是一種由組織培養的接穗與砧木進行嫁接的技術，它是植物組織培養與嫁接技術的結合［2］。微嫁接已被廣泛應用于植物病毒快速檢測［3-4］、珍貴育種材料繁殖保存、植物病毒脫除［5］、接口部位生理與組織結構研究以及工廠化苗木快繁等方面［6］。微嫁接通常分試管內嫁接和試管外嫁接兩種［7］：試管內微嫁接技術開發于1972年［8］，該技術中不同品種的砧木與接穗均為組培苗，在組織培養條件下進行嫁接；試管外微嫁接技術是將無毒的組培苗作為接穗、種子萌發而成的健壯種苗作為砧木，在自然環境中進行嫁接。與常規的嫁接方法相比，試管外微嫁接具有其自身特有的優越性［9］，如作為組培苗來源的接穗生長周期短、費用低、占地少；接穗不受季節限制和環境影響，可隨時從實驗室取材；種子發育而來的砧木可為接穗提供充足的營養來源，抵抗病害，促進接穗快速生長。【前人研究進展】雖然微嫁接技術已應用于棗［10］、柑橘［11］、蘋果、葡萄、桃、沙田柚和龍眼等多種果樹［1］，以及金焰彩欒［12］、麻瘋樹［13］等木本植物的研究和生產中，但由于蔬菜組培苗的組織幼嫩、操作技術要求高、培養條件嚴格，目前為止尚無在苦瓜乃至蔬菜類種植中應用的報道。【本研究切入點】前期相關研究已表明，在相同的栽培條件下，苦瓜組培苗長勢普遍較對應的種子苗弱，但是其葉色、分枝性、果實形態特征、單瓜重量和單株產量與種子苗無明顯差異，且具有提早成熟、整齊度高等優點［14］。【擬解決關鍵問題】本試驗對大頂苦瓜組培苗在試管外微嫁接技術進行了研究，以期提高大頂苦瓜組培苗的栽培水平，為今后蔬菜類試管外微嫁接技術在工廠化育苗的推廣及應用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試接穗材料為2017年3月在廣州市農業科學研究院南沙展示基地種植的頂培1號苦瓜，是該研究院選育的雜交品種單株組培擴繁苗；砧木選擇絲瓜銀砧1號、絲瓜銀砧2號和南瓜海砧1號，購自福建省農業科學院品種資源研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 接穗的獲得 取頂培1號苦瓜萌發的頂芽或側芽為外植體，經消毒滅菌后逐步接種在誘導、繼代培養基上，外植體的具體培養方法參照文獻［14］進行。培養約20 d后，將生長健壯、莖干直徑達0.2～0.25 cm、高5～7 cm的組培苗進行強光煉苗4～9 d，再剪成帶2個芽的莖段作為接穗，將接穗下部削成楔形，然后將其置于在一定濃度（0、0.3、0.5、0.7 mol/L）的6-BA中浸蘸5 s，備用。

1.2.2 砧木的培養 南瓜或絲瓜的種子先經過50～60℃溫水浸種和31～33℃催芽處理，待種子芽露白后，播種于已澆足澆透水的營養缽中，再蓋上一層經多菌靈（稀釋200倍）滅菌的細沙土。種子播種后仍保持基質濕潤，將約7 d后發芽并長出一定數量真葉的植株作為砧木。

1.2.3 嫁接方法 由于蔬菜組織較為細嫩，本研究采用劈接法。待南瓜或絲瓜長出真葉后，剪去真葉和中心生長點，只留兩片子葉，且從兩片子葉中間劈開，將底部削成楔形的接穗插入砧木切口，用橡皮套管+嫁接夾、封口膜、保鮮膜纏繞等不同保濕材料進行保濕和固定處理，7 d后去除綁接材料。

1.2.4 嫁接后培養 嫁接后，將嫁接苗置于溫室內的全封閉小拱棚內，溫度保持在25～30℃，每天對嫁接部位噴灑一定濃度（0%、3%、6%、9%）的蔗糖溶液。前4 d拱棚內保持在一定的高濕度（85%、90%、95%、100%）條件，用黑紗全遮光處理；從第5天開始逐漸通風，降低棚內濕度至80%～85%，逐漸增加光照直至接穗發芽并長出2片新葉，撤去遮光黑紗；1周后及時剪去砧木發出的萌蘗；約20 d后獲得嫁接苗的杯苗，再移栽到大田種植。

1.2.5 試驗數據統計分析 每組試驗取25～30株外植體，3次重復，取平均值。試驗數據采用SPSS Statistics 17.0統計軟件進行方差分析和鄧肯多重比較。

芽長增加量（cm）=成活嫁接苗接穗長度-嫁接當天接穗長度

株高增加量（cm）=成活嫁接苗總株高-嫁接當天總株高

2 結果與分析

2.1 嫁接口的固定保濕條件對大頂苦瓜嫁接苗成活率的影響

與試管內微嫁接能保持恒溫恒濕條件不同，本試驗的嫁接操作均在普通大氣環境中進行，因此嫁接口的保濕對接口的愈合起著至關重要的作用。但組培芽組織相對于取自種子苗的芽又非常細小幼嫩，稍有不慎就容易干枯，因此對嫁接部位固定和保濕條件的選擇需非常謹慎。本試驗主要采取橡皮套管+嫁接夾、封口膜和保鮮膜等3種方式對嫁接傷口進行固定、愈合和保濕處理。由于蔬菜作為嫁接材料比較細小，用封口膜和保鮮膜纏繞嫁接口的操作比較費時費力，并且在操作過程中易使接穗脫落，在這兩種方式下嫁接成活率僅為12%～14%。而嫁接夾操作要比用封口膜和保鮮膜纏繞簡捷，配上橡皮套管會顯著提高保濕效果，成活率達到62.7%。約7 d后可取下嫁接夾（圖1），統計嫁接成活率。

嫁接后前4 d，小拱棚中濕度的保持對大頂苦瓜嫁接苗的成活率也有很大影響。隨著濕度的增加，大頂苦瓜嫁接苗成活率也逐步提高，但濕度太高也容易造成霉菌滋生，從而導致嫁接苗腐爛。當濕度為85%、90%時，嫁接成活率分別為40.9%和52.3%；當濕度保持在95%時，嫁接成活率最高、達到60%以上；但當濕度繼續升高為100%時，由于大部分苗腐爛，嫁接成活率反而低于40%。

圖1 大頂苦瓜嫁接苗采用嫁接夾（左）及嫁接7 d后長勢（右）Fig. 1 The broad-shoulder bitter gourd micrografted with grafting clip (left) and the growth vigor after 7 days (right)

2.2 接穗煉苗時間對大頂苦瓜嫁接苗成活率和接穗長度增加量的影響

由于作為接穗的頂培1號組培苗不定芽長期生長在恒溫恒濕、恒定光照并且完全無菌的環境中，將其移栽至自然條件下需要經過一段適宜的煉苗環節。不同的煉苗時間對嫁接成活率以及嫁接后接穗長度的增加量都有一定影響。由表1可知，煉苗時間低于5 d時，嫁接成活率較低，接穗增長不明顯；煉苗時間6～7 d，嫁接成活率超過60%，接穗增加量與其他時期有明顯差異；隨著煉苗時間的延長，接穗增加量稍有增加，但嫁接成活率又逐漸下降，9 d后下降到不足40%。因此，苦瓜組培苗最適宜的煉苗時間為6～7 d。

表1 接穗煉苗時間對大頂苦瓜嫁接苗成活率和接穗長度增加量的影響Table 1 Effect of different hardening time on the survival rate and increment in scion length of the micrografted seedlings

2.3 砧木種類和苗齡對大頂苦瓜嫁接苗成活率和株高增加量的影響

不同種類的砧木以及砧木的木質化程度會直接影響嫁接成活率。本試驗分別以絲瓜銀砧1號、絲瓜銀砧2號和南瓜海砧1號作為砧木，研究當2片真葉長度0、0.5、1.0、1.5 cm時，嫁接15 d后對大頂苦瓜嫁接苗成活率以及株高增加量的影響。從表2可以看出，當絲瓜銀砧1號的2片真葉長度達0.5 cm時，大頂苦瓜嫁接苗的成活率和株高增加量均較高；南瓜海砧1號真葉0.5 cm時，大頂苦瓜嫁接苗的株高增加量最大，但是嫁接成活率明顯低于銀砧1號，因此首選帶有2片約0.5 cm真葉苗齡的銀砧1號作為砧木進行微嫁接。

表2 砧木種類和苗齡對大頂苦瓜嫁接苗成活率和株高增加量的影響Table 2 Effect of species and ages of rootstocks on the survival rate and increment in height of the micrografted seedlings

2.4 6-BA濃度和蔗糖濃度對大頂苦瓜嫁接苗生長的影響

2.4.1 6-BA濃度 植物生長調節劑特別是生長素在嫁接過程中起著至關重要的作用，能減輕氧化作用，促進形成層活動，產生大量愈傷組織，形成維管束系統，從而促使嫁接口相互愈合，提高嫁接苗的成活率以及株高增加量。因此，本試驗將接穗末端置于含有0、0.3、0.5、0.7 mol/L 6-BA溶液中浸蘸3 s，結果（表3）表明，在接穗末端接口部位浸蘸6-BA后，確實能夠明顯提高嫁接成活率，并且隨著6-BA濃度的增加，接穗嫁接成活率也相應提高，當6-BA濃度為0.5 mol/L時成活率最高、達65.3%；浸蘸6-BA對嫁接苗的株高增長有一定的促進作用，但與不浸蘸6-BA相比沒有顯著差異。

表3 6-BA濃度對大頂苦瓜嫁接苗生長的影響Table 3 Effect of different concentrations of 6-BA on the growth of the micrografted seedlings

2.4.2 蔗糖濃度 有研究認為，蔗糖對果樹類植物微嫁接植株的葉片大小、總葉片數、葉片生長量及新根比例等都有一定的促進作用［16］，因此本試驗在嫁接操作后采用對嫁接口噴灑一定濃度蔗糖水的方式提高嫁接成活率。從表4可以看出，與噴灑清水相比，對嫁接口噴灑蔗糖水能明顯提高嫁接成活率，嫁接成活率都在50%以上，其中當蔗糖質量分數為6%時，嫁接成活率最高達65.9%。但噴灑蔗糖與否對株高增加量沒有顯著促進作用。

表4 蔗糖濃度對大頂苦瓜嫁接苗生長的影響Table 4 Effect of different concentrations of sucrose on the growth of the micrografted seedlings

2.5 大頂苦瓜微嫁接苗的大田移植和栽培

本試驗采用的接穗組培苗試管外微嫁接技術可以直接獲得微嫁接杯苗，嫁接成活后的大頂苦瓜杯苗培養28 d左右可以長到30～35 cm，直接移到大田栽培后成活率可達60%以上（圖2）。

圖2 大頂苦瓜微嫁接杯苗培養28 d（左）及2個月（右）長勢Fig. 2 The growth vigor of micrografted cup seedlings of the broad-shoulder bitter gourd cultured after 28 days (left) and 2 months (right)

3 討論

棗類試管外嫁接結果表明，微嫁接口的固定以及保濕方法是影響組培苗試管外嫁接成活率高低的首要關鍵因素［10］。在本試驗中，接穗為蔬菜作物的組培苗，相對于果樹而言更加幼嫩、個體更小，因此，選擇保濕效果好、操作簡便的保濕材料尤為重要。本試驗嫁接口選用橡皮套管+嫁接夾的方式，既有良好的保濕作用，又簡便易行，顯著提高了嫁接成活率；并且在后續試驗中，用過的橡皮套管和嫁接夾經過消毒后還能繼續使用，降低了生產成本。

影響組培苗試管外嫁接成活率高低的第二個關鍵因素是接穗質量。接穗應盡量挑選健壯的芽，嫁接前用植物生長調節劑（如6-BA）浸蘸削好的楔形底部，更有利于接穗生長；其次應進行強光煉苗，因為強光煉苗可以誘導幼嫩的組培苗莖葉保護組織的形成和恢復氣孔調節功能，使其對水分脅迫和環境因子的抗性明顯增強，這與及華等［15］研究結果一致。煉苗時間短于5 d，接穗組培苗木質化程度不足，嫁接時容易干枯，隨著煉苗時間延長至8 d后，組培苗莖桿的木質化程度提高，與砧木的傷口不易愈合，嫁接苗的成活率逐漸下降，接穗增長量雖然有所增加卻未達到顯著差異，這與成密紅等［17］、王國平等［18］研究結果一致。

以往研究均表明，砧木的種類和苗齡對嫁接苗成活與否常起著關鍵作用。在本試驗中，砧木第1次出現兩片真葉且長度達到0.5 cm時，嫁接效果最佳，隨著砧木苗齡增加，嫁接效果變差，且以絲瓜作為砧木的微嫁接成活率高于南瓜為砧木。這可能是由于砧木苗齡越大，維管組織成熟度越高，愈傷形成能力下降，接穗無法及時從砧木獲得營養物質而干枯死亡所致。與南瓜相比，絲瓜與苦瓜更易親和。

組培苗嫁接后的管理也是嫁接成敗的關鍵，除了嫁接口的保濕外，周圍環境的濕度也很重要。以往研究表明，濕度通常應該前期高后期低，之后濕度逐漸降低至與周圍環境濕度一致。嫁接苗前期遮蔭也有利于嫁接口的傷口愈合。我們經過多次試驗發現，當環境濕度達到100%時，霉菌滋生嚴重，造成嫁接苗大多腐爛、成活率較低；而環境濕度過低，接穗容易失水枯萎。有研究表明，一定濃度的蔗糖水對嫁接苗的成活和生長有一定的促進作用，本研究在嫁接后嘗試采用噴灑一定濃度蔗糖水的方法，嫁接成活率確有提高，但是嫁接苗株高增長量沒有提高，這可能是蔗糖作為碳源促進了組培苗接穗的成活。

本試驗采用的組培苗試管外微嫁接技術，可以直接獲得微嫁接杯苗，中間減少了組培苗生根及煉苗后移栽等環節，嫁接成活后的杯苗培養28 d左右可以長到30～35 cm，直接移到大田栽培成活率可達60%以上。這種微嫁接營養杯苗可周年生產，不受季節限制，且1株5～7 cm高的組培苗可以獲得2～3個接穗，降低了生產成本。苦瓜組培苗試管外微嫁接技術的應用，將有利于提高苦瓜組培苗的栽培成活率、縮短苦瓜的育種年限，并為其他蔬菜類作物試管外微嫁接技術的開發提供借鑒。

4 結論

首次建立了大頂苦瓜組培苗試管外微嫁接技術體系。在該體系中，大頂苦瓜組培苗接穗最適宜的煉苗時間為6～7 d；嫁接口的固定和保濕對嫁接成活與否很重要，采用橡皮套管加嫁接夾包裹嫁接口操作容易，保濕效果顯著；選擇帶兩片真葉的絲瓜銀砧1號作為砧木嫁接成活率高；嫁接前，接穗末端浸蘸0.5 mol/L 6-BA，并且在嫁接后每天噴灑6%蔗糖溶液可以大大提高嫁接苗的成活率，獲得最高嫁接成活率是65.9%。該技術的應用將改善在相同栽培條件下，苦瓜組培苗長勢比實生苗弱的特點，提高苦瓜組培苗的成活率。