油棕細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及植株再生技術(shù)

潘登浪 ，鄒積鑫 ，曾憲海 ，林位夫 ，Khengtuan Chean

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所熱帶林木種子種苗工程中心，海南 海口 571701；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油棕種質(zhì)資源圃/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州熱帶作物科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，海南 儋州 571737）

【研究意義】油棕（Elaeis guineensisJacq.）屬棕櫚科油棕屬植物，是著名的熱帶木本油料作物，被譽(yù)為“世界油王”［1］，是馬來西亞、印度尼西亞等國的主要經(jīng)濟(jì)作物，也是我國擬重點(diǎn)發(fā)展的木本油料作物之一。目前油棕商業(yè)種植普遍采用duru和pisifera雜交的F1代種植材料，其個(gè)體間產(chǎn)量和農(nóng)藝性狀差異大，其中優(yōu)異單株可超過雜種平均產(chǎn)量的30%［2-3］或以上。而這些優(yōu)異油棕單株是基因雜合體，其雜交后代遺傳性狀難以保存親本優(yōu)良特性，況且油棕只有一個(gè)生長點(diǎn)，無法通過嫁接無性繁育。組織培養(yǎng)是解決優(yōu)異油棕單株大量種苗繁育的有效途徑，但油棕傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方式的組培技術(shù)效率低，為此，人們開展了油棕細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的探索。

【前人研究進(jìn)展】油棕細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其植株再生技術(shù)是高效的組培技術(shù)體系，其從外植體到量化生產(chǎn)的再生植株可比固體培養(yǎng)技術(shù)體系短11 個(gè)月［4］。迄今 Touchet等［5］和 Teixeira 等［6］分別報(bào)道了2個(gè)不同油棕細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)體系。Sompong等［7］研究比較了不同細(xì)胞分裂素種類（KN和BA）對在懸浮培養(yǎng)中的細(xì)胞增殖與葉綠體發(fā)育的影響，結(jié)果表明低濃度KT促進(jìn)油棕細(xì)胞增殖和葉綠體發(fā)育，高濃度KT、6-BA抑制細(xì)胞增殖，不利于葉綠體發(fā)育。Kramut等［8］報(bào)道了不同基本培養(yǎng)基（MS和Y3）、不同生長素種類（NAA、Di、2，4-D）及濃度（0.1～0.5 mg/L）、不同碳源（蔗糖30 g/L、山梨醇36.4 g/L）對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞增殖的影響。相關(guān)研究報(bào)道對不同材料公布的技術(shù)工藝不同，且未公布如易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)等技術(shù)細(xì)節(jié)，懸浮細(xì)胞增殖效、體胚萌芽率等有待進(jìn)一步提高。國內(nèi)未見油棕懸浮培養(yǎng)研究報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】綜合前人研究，主要集中在不同激素濃度及其組合對油棕易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，不同培養(yǎng)基對油棕體細(xì)胞懸浮系增殖與后續(xù)體胚發(fā)育的影響和體胚植株再生。【擬解決關(guān)鍵問題】本研究以現(xiàn)存我國優(yōu)良油棕單株嫩葉來源的愈傷組織為外植體，探明其易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)，解決易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低、胚性懸浮細(xì)胞增殖慢等問題，建立油棕胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其植株再生技術(shù)，為我國優(yōu)良油棕?zé)o性系種植材料高效繁育、細(xì)胞生物學(xué)研究、生物技術(shù)育種研究等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017—2018年在海南省儋州市新村寶島中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所油棕組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。以源于RY8成齡油棕樹芯葉的瘤狀愈傷組織為材料。油棕母樹為來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所為依托單位的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油棕種質(zhì)資源圃優(yōu)良單株，瘤狀愈傷組織誘導(dǎo)參照鄒積鑫等［9］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo) 取瘤狀愈傷組織團(tuán)粒（直徑約為3～5 mm），接種到基本培養(yǎng)基為改良WPM，并附加不同質(zhì)量濃度2,4-D（0.50 、1.00 mg/L）或 2,4-D（0.50 、1.00 mg/L）、麥草畏（0.50 、1.00 mg/L）與德夸霉素（0.10 mg/L）組合的激素培養(yǎng)基，共6個(gè)處理。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種50胚團(tuán)。培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)，溫度28（±2）℃。誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d后觀察統(tǒng)計(jì)易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.2 懸浮細(xì)胞系的建立及其生長特性測量 取1.2.1試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長旺盛、質(zhì)地松散的易碎胚性愈傷組織1 g，置于150 mL三角瓶中，并添加30 mL細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基（培養(yǎng)液配方為優(yōu)化的培養(yǎng)基去除瓊脂），置于往復(fù)式搖床上在100 r/min、28（±2）℃、室內(nèi)自然散射光條件下培養(yǎng)，每7 d繼代1次，每次繼代時(shí)傾去占總體積2/3的上清液，補(bǔ)充新鮮的懸浮培養(yǎng)液至30 mL繼續(xù)培養(yǎng)，第3次繼代培養(yǎng)后，用0.83 mm孔徑已滅菌的不銹鋼篩網(wǎng)過濾懸浮細(xì)胞，只保留能通過0.83 mm孔徑篩網(wǎng)的懸浮細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，獲得生長狀態(tài)較均一、分散性好的細(xì)胞團(tuán)即懸浮細(xì)胞系。以已建立好的懸浮細(xì)胞系為材料，測生長曲線：取上述懸浮細(xì)胞系細(xì)胞密實(shí)體積（PCV）0.5 mL，接種到加有30 mL培養(yǎng)液的150 mL三角瓶中懸浮培養(yǎng)；每2 d取整瓶懸浮液置于離心管（已滅菌）經(jīng)1 000 r/min離心5 min后，測細(xì)胞密實(shí)體積（PCV），然后放回三角瓶繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d共測7次。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3瓶。試驗(yàn)結(jié)束后，以測得培養(yǎng)物平均PCV繪制生長曲線。

1.2.3 油棕懸浮細(xì)胞系增殖 取已建立好的懸浮細(xì)胞系0.2 g接種到基本培養(yǎng)基為改良WPM，并附加1.00 mg/L麥草畏與不同濃度TDZ（0 、0.10 mg/L）、ZT（0.01 、0.05 、0.10 mg/L）、KT（0.10 mg/L）、德夸霉素（0.10、0.30、0.50 mg/L）共9種激素組合（處理）的各培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基20 mL/瓶, 28（±2）℃、室內(nèi)自然散射光、100 r/min下懸浮培養(yǎng)14 d，測細(xì)胞鮮重。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3瓶。

1.2.4 懸浮細(xì)胞系分化與植株再生 取含1.2.3實(shí)驗(yàn)中所列各激素組合的各培養(yǎng)基上培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞系1 mL PVC轉(zhuǎn)到MS+谷氨酰胺100 mg/L +蔗糖30 g/L培養(yǎng)基上，于28（±2）℃，2 000 lx下培養(yǎng)進(jìn)行胚誘導(dǎo)，每14 d更換新培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)60 d觀察統(tǒng)計(jì)懸浮系分化成大于1 mm的胚團(tuán)數(shù)量。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種3瓶。將大于1 mm胚團(tuán)轉(zhuǎn)到無激素MS+谷氨酰胺100 mg/L +蔗糖30g/L固體培養(yǎng)基進(jìn)一步成熟與萌芽。

采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)初步整理和作圖，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度及其組合對易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以油棕芯葉瘤狀愈傷組織為材料，較低濃度2,4-D、2,4-D或麥草畏與德夸霉素組合可誘導(dǎo)獲得油棕易碎胚性愈傷組織（圖1）。試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，在不同質(zhì)量濃度2,4-D、2,4-D或麥草畏與德夸霉素組合培養(yǎng)基誘導(dǎo)油棕易碎胚性愈傷組織，其誘導(dǎo)率存在差別；在供試濃度范圍內(nèi)麥草畏比相應(yīng)濃度的2,4-D對易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)更有利；0.10 mg/L德夸霉素與一定濃度2,4-D或麥草畏組合促進(jìn)胚性愈傷組織形成。在供試激素組合中，1.00 mg/L麥草畏+0.10 mg/L德跨霉素最適于供試材料誘導(dǎo)易碎胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率高達(dá)28.67%。

表1 不同激素濃度及其組合對油棕易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 1 Effects of different hormone concentrations and their combinations on the induction of friable embryogenic callus of oil palm

圖1 易碎胚性愈傷組織Fig. 1 Frable embryogenic callus

2.2 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立

取生長旺盛、質(zhì)地松散的油棕易碎胚性愈傷組織1 g，置于150 mL三角瓶中，并添加30 mL細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基（培養(yǎng)液配方為優(yōu)化的培養(yǎng)基去除瓊脂），置于往復(fù)式搖床上在100 r/min、28（±2）℃、室內(nèi)自然散射光條件下培養(yǎng)，每7 d繼代1次，每次繼代時(shí)傾去占總體積2/3的上清液，補(bǔ)充新鮮的懸浮培養(yǎng)液至30mL繼續(xù)培養(yǎng)，第3次繼代培養(yǎng)后，用0.83 mm孔徑已滅菌的不銹鋼篩網(wǎng)過濾懸浮細(xì)胞，只保留能通過0.83 mm孔徑篩網(wǎng)的懸浮細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，即獲得生長狀態(tài)較均一、分散性好的細(xì)胞團(tuán)即懸浮細(xì)胞系（圖2）。

圖2 油棕細(xì)胞懸浮培養(yǎng)Fig. 2 Cell suspension culture of oil palm

2.3 懸浮細(xì)胞系生長特性

從圖3可見，油棕胚性懸浮細(xì)胞系在轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基后，培養(yǎng)0～6 d懸浮細(xì)胞增殖緩慢；培養(yǎng)6～10 d懸浮細(xì)胞系處于對數(shù)生長期，增殖速度較快；培養(yǎng)10～14 d懸浮細(xì)胞系增殖速度延緩。因此懸浮細(xì)胞系最佳繼代培養(yǎng)周期為14 d左右。

圖3 油棕懸浮細(xì)胞系生長曲線Fig. 3 Growth curve of oil palm suspension cell line

2.4 不同質(zhì)量濃度激素及其組合對油棕懸浮細(xì)胞系增殖的影響

表2數(shù)據(jù)表明，添加TDZ、ZT與麥草畏組合的處理，在供試濃度范圍內(nèi)比單獨(dú)添加麥草畏處理的細(xì)胞鮮重增殖率低，說明TDZ和ZT在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)抑制麥草畏對懸浮細(xì)胞增殖的作用，其中ZT在0.01～0.10 mg/L隨質(zhì)量濃度增加抑制作用增強(qiáng)；適當(dāng)質(zhì)量濃度的KT、德夸霉素可增加麥草畏促進(jìn)懸浮細(xì)胞增殖作用，在供試激素組合中0.30 mg/L德夸霉素與1.00 mg/L麥草畏組合質(zhì)量鮮重增殖倍數(shù)最大，達(dá)7.23倍。

表2 不同激素組合對油棕懸浮細(xì)胞系增殖的影響Table 2 Effects of different hormone concentrations and their combinations on the proliferation of oil palm suspension cell line

2.5 不同質(zhì)量濃度激素及其組合對油棕懸浮細(xì)胞系后續(xù)分化的影響

取含表2所列激素組合的各培養(yǎng)基上培養(yǎng)的1 mL PCV懸浮細(xì)胞系轉(zhuǎn)到MS+谷氨酰胺100 mg/L +蔗糖30 g/L培養(yǎng)基上，于28（±2）℃、2 000 lx下進(jìn)行胚誘導(dǎo)培養(yǎng)，探索不同增殖培養(yǎng)基對油棕懸浮細(xì)胞系后續(xù)體胚發(fā)生的影響，每兩周更換新培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)60 d觀察統(tǒng)計(jì)懸浮系分化成大于1 mm的胚團(tuán)數(shù)量（圖4A，封三）。試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，懸浮細(xì)胞增殖培養(yǎng)基中的不同激素種類及其質(zhì)量濃度對細(xì)胞團(tuán)后續(xù)培養(yǎng)中胚團(tuán)分化能力的作用不同，懸浮增殖培養(yǎng)基中一定濃度范圍TDZ、ZT、KT、德夸霉素均對后續(xù)胚團(tuán)發(fā)育有利，其中0.30 mg/L德夸霉素效果最好（295個(gè)/瓶）。

圖4 懸浮細(xì)胞系體胚發(fā)育與植株再生Fig. 4 Somatic embryos development and regeneration of suspension cell line

表3 不同質(zhì)量濃度激素及其組合對油棕懸浮細(xì)胞系后續(xù)分化的影響Table 3 Effects of different hormone concentrations and their combinations on the subsequent differentiation of suspension cell lines

2.6 懸浮細(xì)胞系分化與植株再生

將大于1 mm胚團(tuán)轉(zhuǎn)到MS+谷氨酰胺100 mg/L +蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L中，在28（±2）℃、2 000 lx下培養(yǎng)，60 d左右獲得成熟胚（圖4B，封三），成熟胚在相同新培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d左右萌芽，繼續(xù)培養(yǎng)60 d左右獲得完整植株（圖4C，封三），平均誘導(dǎo)率達(dá)55%以上。然后轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基（MS+蔗糖3 000 mg/L，pH6.0）中，在28（±）2℃、2 000 lx下進(jìn)行壯苗培養(yǎng)60 d，達(dá)到長出2級根、3張葉片以上完整植株(圖4D，封三）。

3 討論

易碎胚性愈傷組織的獲得是建立高效的懸浮培養(yǎng)及植株再生體系的基礎(chǔ)與關(guān)鍵，胚性愈傷組織質(zhì)量決定建立胚性細(xì)胞懸浮系的效率和成敗。Touchet等［5］用源于成齡油棕樹葉片的瘤狀愈傷組織首次成功建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其植株再生體系，但建立懸浮細(xì)胞系需要超過56 d。Teixeira等［6］分別用源于油棕種子胚的易碎胚性愈傷組織和顆粒較大的球形愈傷組織團(tuán)建細(xì)胞懸浮系，前者需60 d獲得懸浮液，后者需90～150 d獲得懸浮液，而且后者未能實(shí)現(xiàn)植株再生。高晗等［10］用楸樹易碎胚性愈傷組織建立胚性細(xì)胞懸浮系只需15～30 d。張曉麗等［11］描述了其研究獲得的3種青天葵愈傷組織，選其中生命力強(qiáng)、顆粒狀、疏松易碎的淺黃白色胚性愈傷組織進(jìn)行種子細(xì)胞的培養(yǎng)，約用47 d建立較均一的懸浮細(xì)胞系。在Touchet、Teixeira等的科技文獻(xiàn)中未見油棕易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)細(xì)節(jié)公布。本研究探索了不同激素及質(zhì)量濃度對源于成齡油棕葉片愈傷組織誘導(dǎo)易碎胚性愈傷組織的效果，獲得了質(zhì)量良好的易碎胚性愈傷組織，并用該材料建立質(zhì)量優(yōu)良的油棕懸浮細(xì)胞系只需21 d。

外源激素對植物細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織增殖與分化起著重要作用，不同激素對不同物種或不同基因型植物的影響不同。如添加適量的6-BA和TDZ對大豆的子葉節(jié)叢生芽的誘導(dǎo)有一定促進(jìn)作用，但并不能提高苜蓿愈傷的分化能力［12］。對于鈣果葉片分化成芽的誘導(dǎo)，細(xì)胞激動(dòng)素的濃度應(yīng)相對固定，應(yīng)更多考慮調(diào)配生長素如NAA、IAA的質(zhì)量濃度［13］。2 mg/L 6-BA與 0.5 mg/L NAA 組合，最適于頂花板凳果愈傷組織和芽誘導(dǎo)［14］。TDZ對白鶴芋胚性細(xì)胞團(tuán)增長量的影響也十分明顯，在一定質(zhì)量濃度（0～0.50 mg/L）范圍內(nèi)，無論是單獨(dú)TDZ，還是與2,4-D組合均促進(jìn)細(xì)胞增殖［15］。本研究中0.1 mg/L TDZ和ZT不利于油棕懸浮細(xì)胞團(tuán)增殖，適當(dāng)質(zhì)量濃度KT、德夸霉素促進(jìn)油棕懸浮細(xì)胞團(tuán)增殖。

德夸霉素又稱狹霉素A，我國農(nóng)業(yè)應(yīng)用上又稱為靈發(fā)素，具有植物細(xì)胞分裂素的生物活性，被視為一種新的植物生長調(diào)節(jié)劑，已被我國農(nóng)業(yè)科技工作者應(yīng)用于一些植物組織培養(yǎng)研究中［16］。如許宏源等研究發(fā)現(xiàn)靈發(fā)素可以促進(jìn)三七愈傷組織誘導(dǎo)與增殖、體胚發(fā)生與成苗［17-18］；許鴻源等［19］利用LFS直接誘導(dǎo)半夏葉柄莖段獲得愈傷組織和體胚。陳念平等報(bào)道靈發(fā)素可以比傳統(tǒng)2，4-D更高效率地誘導(dǎo)優(yōu)質(zhì)的甘蔗愈傷組織［20］。在本研究中初步發(fā)現(xiàn)適當(dāng)質(zhì)量濃度德夸霉素協(xié)同麥草畏有促進(jìn)誘導(dǎo)油棕胚性愈傷組織效果和促進(jìn)懸浮細(xì)胞增殖及其體胚發(fā)生能力的作用；其對不同基因型油棕培養(yǎng)材料的作用效果如何，單一德夸霉素是否有相同作用等問題，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究以源于成齡油棕芯葉的瘤狀愈傷組織為材料，誘導(dǎo)獲得易碎胚性愈傷組織，建立了較高質(zhì)量的細(xì)胞懸浮系，并獲得再生植株，建立了油棕胚性體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其植株再生技術(shù)體系。研究結(jié)果初步認(rèn)為適當(dāng)質(zhì)量濃度德夸霉素與2,4-D或麥草畏組合，可促進(jìn)油棕芯葉愈傷組織形成易碎胚性愈傷組織；用生長旺盛、質(zhì)地松散的易碎胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)21 d可建立生長狀態(tài)較均一、分散性好的懸浮細(xì)胞系；初步發(fā)現(xiàn)含適當(dāng)質(zhì)量濃度德夸霉素與麥草畏液體培養(yǎng)基利于油棕懸浮細(xì)胞系增殖和后續(xù)體胚發(fā)育。研究結(jié)果可為我國優(yōu)良油棕?zé)o性系種植材料高效繁育、細(xì)胞生物學(xué)研究、生物技術(shù)育種研究等提供參考。