花生青枯病生防細菌的篩選與鑒定

陸 濟，游春平，董章勇

（仲愷農業工程學院農業與生物學院，廣東 廣州 510225）

【研究意義】花生是世界上最主要的油料經濟作物之一，是大部分非發達國家和地區人們的植物油和蛋白質的主要來源，其營養價值極高。我國花生種植面積占所有油料作物種植總面積的1/4，總產量卻占全國油料作物總產量的50%以上，為我國的經濟發展及貿易出口等作出了極其重要的貢獻［1］。細菌性青枯病是一種具有極大毀滅性的土傳病害，其病原為茄青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）［3-4］。青枯病是當前世界發生范圍最廣、危害最大、引起損失最重的一種病害。由此造成的花生減產一般為10%～20%，嚴重時可高達70%，甚至絕收。在很多作物中尚未有有效的防治措施，因此該病害也被稱為植物的“癌癥”［4］。由于青枯菌在寄生范圍、致病能力、生化型等特性上存在很大差異，增加了這種病害的防治難度［3］。數十年來大量的研究者以不同的切入點對青枯菌進行全面的研究探索，雖然取得了一定的進展，但是未能解決生產上的問題。篩選花生青枯病的生物防治菌株對于該病原菌的防控有重要意義，尤其目前我國大力提倡農藥減量的防控。【前人研究進展】近些年來，青枯雷爾氏菌的生物防治越來越多地引起了國內外專家學者的重視。目前已經分離不同的潛在生防菌株，如青枯假單孢桿菌（Pseudomonas solanacarum Smith）［5］、鏈霉菌（Streptomycesspp.）［6］、假單胞桿菌（Pseudomonadaceae）［7］、芽孢桿菌（Bacillus）［8］和閘坡鏈霉菌（Streptomyces zhapoensis）［9］等。篩選到的生物防治菌株包括真菌、細菌和放線菌等。【本研究切入點】雖然前期開發了一些生防制劑，但普遍存在防效不穩定的現象，因此希望開發出更多的生防制劑進行替代和補充［10］。【擬解決的關鍵問題】篩選到對花生青枯病有較好拮抗作用的生物防治細菌菌株，并進行鑒定，為該病的生物防治打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試花生青枯病致病菌株由仲愷農業工程學院植物病理實驗室分離保存。供試培養基為改良的PDA培養基、TTC平板等培養基，其配置參照植物病原細胞研究技術［11］。盆栽試驗花生品種為航花3號，由仲愷農業工程學院鄭奕雄教授提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 花生青枯菌拮抗菌株的分離和純化 將采集自廣州市內公園及仲愷農業工程學院校園的土樣進行風干處理，將風干的10 g植株根部土壤放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中, 放入搖床以170 r/min振蕩30 min, 制成土壤懸浮液。經過稀釋后涂NA平板，再放入28 ℃黑暗的恒溫箱中培養,48 h后挑選出其中典型的單菌落, 經平板劃線進行純化, 并放入4°C冰箱保存待用。

1.2.2 花生青枯病拮抗菌的篩選 經純化的菌株用點接法進行初篩，操作過程如下: 將培養的青枯病菌懸液濃度稀釋為1×108CFU/mL, 從中取0.1 mL均勻地涂抹于NA平板上, 將滅菌后小圓片浸入土壤分離菌中，再放入涂有青枯病菌的平板中央。每個分離物重復3次。于28℃恒溫箱中培養48 h后觀察拮抗效果。

1.2.3 拮抗菌發酵液對花生青枯病菌的抑制作用 將抑制效果較好的拮抗菌株接種到NB液體培養基中，在30 ℃下于170 r/min的搖床中培養2 d，將發酵液在12 000 r/min下離心20 min, 取上清液，經過濾滅菌，獲得無菌發酵液。將浸過無菌發酵液的圓片放入涂有青枯病菌的平板中央。每個拮抗菌株重復3次。于28℃下恒溫箱中培養48 h后觀察拮抗效果，計算抑制率。

1.2.4 拮抗菌的盆栽防治試驗 盆栽防治試驗使用4～5片葉子的苗期進行試驗。先用灌根法接種生防菌，48 h后再接青枯雷爾氏菌液，每種生防菌發酵液澆灌60株植株。以60株直接接種青枯雷爾氏菌液（1.0×108CFU/mL）20 mL作為對照，每個處理3次重復。接種青枯雷爾氏菌液3 d后開始記錄花生植株的生長和發病情況，持續觀察30 d。計算病株率和防治效果。

1.2.5 拮抗菌A38的鑒定 菌株總DNA提取利用東盛生物的細菌基因組DNA快速提取試劑盒進行。PCR擴增引物使用細菌16S rDNA通用引物27F/1492R（White等, 1990）。將擴增產物送交上海英濰捷基貿易有限公司測序，測序得到的結果在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）上進行比對分析。使用軟件MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis，Version6.0）進行序列比較，采用Kimura 2-parameter（Kimura-2參數）模型，采用neighbor joining 程序，boot strap 為1 000次。菌株的生理生化性狀參照《伯杰氏系統鑒定手冊》（第2版）和《常見細菌鑒定手冊》。

2 結果與分析

2.1 花生青枯菌拮抗菌發酵液對花生青枯病菌的抑制作用

采用平板稀釋法從植物根際土壤中分離出300余株形態和顏色不同的細菌菌株，對這些菌株進行花生青枯菌拮抗試驗。結果表明，對青枯雷爾氏菌有拮抗作用的菌株有7株，約占總菌株數的1.8%左右，抑菌圈直徑范圍為5.0～16.0 mm，菌株為Aa、Ab、Af、Ai、A9、A27 和A38，其中A38菌株對花生青枯菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為16.0 mm，其次為Ab和A27菌株，抑菌圈直徑分別為11.5 mm和13.5 mm（表1）。

表1 拮抗菌株對青枯雷爾氏菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of antagonistic bacterial strains on R. solanacearum

2.2 拮抗菌株無菌濾液對青枯雷爾氏菌的抑制作用

選擇抑菌圈直徑大于10.0 mm的3個菌株Ab、A27和A38的無細胞發酵液進行抑菌測定，結果顯示，3個菌株Ab、A27和A38的無細胞發酵液對青枯病菌都有明顯的抑制作用，抑制圈直徑分別為9.5、10.5、15.0 mm，差異極顯著，表明3株細菌的胞外分泌物對青枯雷爾氏菌起拮抗作用。

2.3 生防菌盆栽防治效果

利用前期在平板拮抗試驗中對花生青枯菌有較好拮抗作用的3個菌株進行盆栽防治試驗，結果（表2）表明，拮抗菌Ab、A27和A38對花生青枯病均具有一定的防治效果，防治效果分別為12.16%、25.66%和52.71%，以A38菌株的防治效果較好，此防效有一定的研究價值，可進一步進行大田試驗。

表2 拮抗細菌對花生青枯菌的溫室盆栽防治效果Table 2 Control effects of antagonistic bacteria on bacterial wilt of peanuts in greenhouse

2.4 A38菌株的鑒定

利用通用引物 27F/1492R 對生防菌A38的16S rRNA 基因進行 PCR 擴增，獲得大小為1 435 bp 產物，并與 GenBank 上序列進行比對，結果顯示，與菌株A38 16S rDN A序列相似性99%的細菌只有Pseudomonas aeruginosa。

菌株A38在NA培養基上的菌落為圓形，其顏色乳白不透明，表面有光澤、粘稠狀、微隆起、邊緣光滑、整齊、波狀，在革蘭氏染色中為陰性。

根據上述基因序列分析結果，參照《伯杰氏系統鑒定手冊》（第2版）選擇19項生理生化性狀進行測定，結果(表3）顯示，菌株A38不僅能對部分糖或醇如木糖、核糖、半乳糖和葡萄糖等都能進行有效的利用，并且菌株A38能使明膠液化，但不能進行反硝化作用，能在42℃下生長，但卻不能在8.5%NaCl下生長。生理生化特征測定結果也表明A38菌株的特性與綠膿假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）的特性相似，相似性達78.95%。

表3 生防菌A38的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of biocontrol bacterium A38

3 討論

國內外篩選出的生防菌有不少都得到了推廣利用，防治效果比較具有優勢的如弱毒性青枯假單孢桿菌的使用、熒光假單孢桿菌及芽孢桿菌的利用［12-13］。測定的生防菌的防效還不是很高，希望進一步篩選獲得防效更高的生防菌。福建省農科院培育出的青枯病生防菌ANTI-8098A對青枯病的控制效能較好［14］。本試驗從作物根際土壤中分離得到300余種菌株，通過多次平板拮抗試驗，有3株拮抗菌室內試驗篩選中對青枯雷爾氏菌抑制效果較好，分別為Ab、A27、A38菌株。再使用對花生青枯病中抗的花生品種航花3號進行進一步的盆栽試驗。拮抗菌株A38的防效顯著高于其他兩個菌株，防效達到52.71%。該菌株可進一步用于花生青枯病菌的生物防治與利用。

利用16SrRNA基因往往能進行到屬水平的鑒定，但卻不能鑒定到種，往往還需要借助其他基因進行進一步的鑒定。喻國輝等［15］基于16SrRNA基因的測序結果構建系統發育樹無法區分種間關系，而利用gyrB基因構建系統發育樹則目的菌與Bacillus subtilis在同一個分支上，但無法區分與哪個變種的親緣關系比較近。王成義等［16］使用16SrRNA基因和recA基因擴增香魚鰻利斯頓氏菌并構建系統發育樹，認為recA基因比16SrRNA基因更具有種間的分辨力。細菌的鑒定往往除了利用16SrRNA基因進行，還需要輔以其他基因共同進行，或者進行生理生化的測試共同進行。本研究利用16SrRNA和生理生化指標，將對花生青枯病有拮抗效果的A38菌株鑒定為綠膿假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）。

4 結論

本研究篩選到一株對花生青枯病有較好拮抗作用的菌株A38，初步鑒定為綠膿假單胞桿菌。利用盆栽試驗驗證該菌株的防治效果較好，達到52.72%。