茶樹生長素合成酶基因YUCCA10克隆與表達分析

楊方慧，夏麗飛，蔣會兵，孫云南，田易萍，梁名志，陳林波*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/云南省茶樹種質(zhì)資源創(chuàng)新與配套栽培技術(shù)工程研究中心，云南 勐海 666201；2.云南省茶學(xué)重點實驗室，云南 勐海 666201)

【研究意義】茶樹(Camelliasinensis)是一種重要葉用經(jīng)濟作物，是多年生的異花授粉植物。茶樹花屬完全花，兩性花，由花托、花萼、花冠、雄蕊群和雌蕊組成，是茶樹繁育后代的重要器官，花器官的正常發(fā)育是茶樹賴以繁衍的基礎(chǔ)[1]。然而，作為葉用作物的茶樹，開花結(jié)果會消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。因此，開展茶樹花發(fā)育的相關(guān)研究具有重要的理論意義和實踐意義。【前人研究進展】生長素(即吲哚-3乙酸，indole-3-acetic acid, IAA)是調(diào)控植物諸多生物過程的重要內(nèi)源激素，參與植物生殖發(fā)育的多個過程，包括雄蕊形成，花絲延伸，花粉發(fā)育及花藥開裂等[2-3]。生長素在植物中的生物學(xué)功能主要通過其合成、運輸及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)3個過程來實現(xiàn)，損害或抑制任何一個過程都會影響植物的正常生長發(fā)育以及對環(huán)境適應(yīng)性的響應(yīng)[4-5]。YUCCA基因家族是一類編碼類黃素單加氧酶(flavin monooxygenase-like enzyme, FMO)基因，可催化吲哚丙酮酸直接轉(zhuǎn)變成IAA，是色氨酸依賴的吲哚乙酸生物合成途徑中的一個限速酶，在維持生長素含量方面起著關(guān)鍵作用[6-8]。目前，YUCCA同源基因已在多種植物中得到克隆，如草莓[9]、煙草[10]、擬南芥[2]和水稻[11]等，其中擬南芥中有11個YUCCA基因[2]，水稻基因組中鑒定出7個類YUCCA基因[11]。【本研究切入點】本研究基于前期挖掘茶樹花不育相關(guān)基因時[12]，篩選出一條與YUCCA10基因高度同源的基因序列，通過對‘云茶1號’的全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)查找[13]，獲得含有完整編碼的YUCCA10基因CDS序列，再對其序列進行克隆驗證，并對YUCCA10基因的基本生物信息學(xué)特征進行分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】探究YUCCA10基因在正常花和不育花中的表達規(guī)律，為深入探索YUCCA10基因和生長素合成對茶樹花器官發(fā)育的調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗基地的正常茶樹‘云抗10號’(目前利用該材料作為父本、母本均能獲得子代)以及不育茶樹，該不育茶樹為利用‘佛香2號’與‘福鼎大白茶’雜交獲得的一株不育花(參見文獻[12,14])的花芽、花蕾、含苞待放花以及取正常茶樹‘云抗10號’的芽、葉、莖、幼果、花瓣、雄蕊、雌蕊和不育花花瓣、雄蕊、雌蕊作實時熒光定量PCR檢測用。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

利用Trizol提取試劑盒，分別提取上述各樣品的總RNA，通過跑1 %的瓊脂糖凝膠電泳方法分析RNA的完整性以及是否有污染，利用Nanodrop檢測RNA的濃度，將檢測合格的總RNA樣品利用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA用于基因驗證，利用RevertAid Premium Reverse Transcriptase合成試劑盒合成cDNA用于實時熒光定量PCR分析。

1.3 CsYUCCA10基因CDS片段驗證

根據(jù)查找獲得的CsYUCCA10基因CDS序列設(shè)計4對特異引物(表1)進行CsYUCCA10基因的擴增驗證，通過跑膠回收后，將純化后的基因送到上海生工生物工程股份有限公司進行基因測序。

1.4 CsYUCCA10基因序列的生物信息學(xué)分析

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站進行BlastX比對分析；應(yīng)用BioXM2.6軟件進行氨基酸組成分析、多重序列比較和同源性分析；利用工具ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/)在線分析蛋白的等電點和分子量；運用軟件SOPMA預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.5 CsYUCCA10基因的qRT-PCR分析

以GAPDH基因(GE651107.1)為內(nèi)參，利用驗證后的CsYUCCA10基因序列，按照熒光定量PCR引物設(shè)計原則設(shè)計引物(表1)。參照BBI的SG Fast qPCR aster Mix定量PCR試劑和利用德國LightCycler 480進行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min后；采用變性溫度95 ℃ 7 s，退火溫度57 ℃ 10 s，延伸溫度72 ℃ 15 s，45個循環(huán)；最后72 ℃延伸15 s。設(shè)實驗重復(fù)3個，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 CsYUCCA10基因CDS驗證和序列分析

在前期利用數(shù)字表達譜技術(shù)篩選茶樹不育基因時[12]，獲得一條與吲哚-3丙酮酸氧化酶(YUCCA10)基因高度同源的基因，該基因在‘福鼎大白茶’(父本花)和‘佛香2號’(母本花)中上調(diào)表達，在其雜交后代不育花中為下調(diào)表達。為了獲得該基因完整編碼序列，從‘云茶1號’全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中查找到一條序列為1697 bp的CDS[13]，通過NCBI中Blastx比對顯示它具有YUCCA10完整的開放閱讀框(ORF)。為了驗證其全長，CDS設(shè)計4對特征引物進行擴增，經(jīng)過高保真酶擴增(圖1)，分別將4對引物擴增的PCR產(chǎn)物回收測序拼接后，獲得含有1137 bp的ORF(圖2)，編碼379個氨基酸，命名為CsYUCCA10。

1：特征引物YUCCA-1F和YUCCA-1R擴增產(chǎn)物；2：特征引物YUCCA-2F和YUCCA-2R擴增產(chǎn)物；3：特征引物YUCCA-3F和YUCCA-3R擴增產(chǎn)物；M：DL 10 000 marker；4：特征引物YUCCA-4F和YUCCA-4R擴增產(chǎn)物1: Amplification product of characteristic primers YUCCA-1F and YUCCA-1R; 2: Amplification product of characteristic primers YUCCA-2F and YUCCA-2R; 3: Amplification product of characteristic primers YUCCA-3F和YUCCA-3R; M: DL 10 000 marker; 4: Amplification product of characteristic primers YUCCA-4F and YUCCA-4R圖1 CsYUCCA10基因CDS擴增驗證Fig.1 CDS amplification verification of CsYUCCA10 genes

2.2 CsYUCCA10基因的生物信息學(xué)分析

通過NCBI在線分析，該蛋白含有保守功能結(jié)構(gòu)位點CzcO，屬于 Pyr_redox_2超級家族(圖3)，利用在線工具ExPASy預(yù)測其理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)的相對分子量為42.63 kDa，等電點8.88，說明該蛋白為堿性蛋白質(zhì)。利用在線工具SOPMA預(yù)測CsYUCCA10蛋白的二級結(jié)構(gòu)，含有α螺旋31.66 %，延伸鏈18.21 %，無規(guī)則卷曲42.48 %，β折疊7.65 %。

圖2 CsYUCCA10 CDS與推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 CDS sequences of CsYUCCA10 and their deduced amino acids

圖3 CsYUCCA10蛋白功能性位點分析Fig.3 Functional site analysis of CsYUCCA10 protein

通過CsYUCCA10的氨基酸同源序列比對，發(fā)現(xiàn)與獼猴桃(Actinidiachinensisvar. Chinensis，登錄號為PSR86028.1)相似性為81 %，與橄欖(Oleaeuropaeavar. Sylvestris，登錄號為XP_022869081.1)的相似性為71 %，與葡萄(Vitisvinifera，登錄號為XP_002269763.1)和蓮(Nelumbonucifera，登錄號為 XP_010245350.1)相似性為73 %。在擬南芥YUC基因家族蛋白中均含有黃素單加氧酶共有的還原型輔酶Ⅱ結(jié)合位點(NADPH-binding site)和FAD結(jié)合位點(FAD-binding site)[15]。分析發(fā)現(xiàn)茶樹CsYUCCA10基因中的FAD-binding site序列為GAGPSG，NADPH-binding site序列為GSGNSG(圖4)，這2個位點保守域中甘氨酸殘基對于輔因子結(jié)合和黃素單加氧酶活性是必須的。茶樹CsYUCCA10具有保守甘氨酸殘基，說明茶樹CsYUCCA10具有其功能。

2.3 茶樹CsYUCCA10基因的表達分析

采用實時熒光定量PCR技術(shù)，分析茶樹CsYUCCA10基因在正常花和不育花不同發(fā)育期中的表達特征發(fā)現(xiàn)(圖5)，在正常花中隨著花的生長發(fā)育表達量增加，花蕾為花芽的5.07倍，到含苞待放時表達最高，為花芽的6.1倍；然而在子代不育花中隨著花的發(fā)育，表達呈減少趨勢，花蕾期下降為花芽期的0.44倍，含苞待放期下降為花芽期的0.26倍；CsYUCCA10在正常花的花瓣、雄蕊、雌蕊均顯著高于不育花(圖6)，在不育花中的表達量分別為正常花花瓣、雄蕊、雌蕊的0.13、0.04和0.07倍。這些結(jié)果說明了吲哚-3丙酮酸氧化酶基因在不育花中不能正常表達，均低于正常花，推測不育花中生長素不能正常合成，影響了花的發(fā)育導(dǎo)致不育。同時還分析了CsYUCCA10在正常茶樹不同組織中的表達特性，發(fā)現(xiàn)在葉片和莖中表達量最高，在果中表達量最低，是葉的0.08倍(圖7)，說明CsYUCCA10的表達具有組織特異性。

方框A：FAD位點；方框B：NADPH位點Box A: FAD-binding site; Box B: NADPH-binding site圖4 CsYUCCA10與其他YUCCA10基因的氨基酸比對Fig.4 Comparison of amino acid sequences of CsYUCCA10 with other reported YUCCA10 proteins

圖5 CsYUCCA10在花不同發(fā)育期的表達特征Fig.5 The expressions of CsYUCCA10 in flowers of different development terms

圖6 CsYUCCA10在花不同組織中的表達特征Fig.6 The expressions of CsYUCCA10 in flowers of different tissues

3 討 論

花是被子植物的繁殖器官，花的發(fā)育是植物繁衍后代的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，受到多種因素的調(diào)控。對生長素的生物合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及極性運輸相關(guān)突變體的研究表明，生長素在花器官的形成和發(fā)育中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[16-17]。植物中生長素的合成主要包括依賴色氨酸(Trp-dependent pathway)途徑和非依賴色氨酸(Trp-independent pathway)途徑，其中依賴于色氨酸的生長素合成途徑是植物中主要的途徑[15,18]。YUCs是依賴于色氨酸生長素合成途徑中的關(guān)鍵基因，證明YUC基因家族在生長素的生物合成以及植物發(fā)育過程的作用證據(jù)來自于對擬南芥的yuc缺失突變體的研究。如擬南芥yuc2yuc6雙突變體，其表現(xiàn)為雄蕊發(fā)育缺陷，而yuc1yuc4雙突變體表現(xiàn)為花器官發(fā)育受阻，且沒有完整的花器官，全部敗育[2,19]。

圖7 CsYUCCA10組織特異性表達模式Fig.7 The tissue specific expression pattern of CsYUCCA10

本研究利用全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，驗證克隆了1個含有完整編碼的茶樹YUCCA10基因，該基因開放閱讀框為1137 bp，編碼378個氨基酸，與其他植物的YUCCA10具有較高的相似性，并且含有FAD和NADPH位點以及與輔因子結(jié)合和黃素單加氧酶活性結(jié)合所必須的甘氨酸殘基，說明茶樹YUCCA10在生長素合成途徑中發(fā)揮其功能。采用qRT-PCR技術(shù)，檢測茶樹YUCCA10基因在正常茶樹花和不育花中的表達規(guī)律，結(jié)果表明，YUCCA10基因表達量在正常花的花瓣、雄蕊、雌蕊中要顯著高于不育花；在不同發(fā)育期，正常花中隨著花的生長發(fā)育其表達量呈增加趨勢，而不育花呈現(xiàn)減少趨勢且顯著低于正常花；茶樹YUCCA10基因的表達還具有組織特異性。擬南芥中有YUCCA基因家族成員11個，都被證明參與了生長素的生物合成過程，其表達受到嚴格的調(diào)控，在時間和空間上調(diào)節(jié)模式有明顯的不同來控制生長素合成的時空分布[2-3,7]。小麥的YUCCA10在生殖器官如花和種子中強烈表達，導(dǎo)入擬南芥有植株高大、莖稈粗壯的特點，存在部分植株敗育，后期花器官變形、花的結(jié)構(gòu)減少以及不能產(chǎn)生花粉，說明小麥YUCCA10對花器官和種子的形成起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[20]。在擬南芥中YUCCA10參與胚胎發(fā)育與葉片形成[2,21]。因此，推測茶樹YUCCA10可能參與花器官形成和葉片發(fā)育。

生長素對植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)主要依賴于生長素的合成、極性運輸能使生長素積累在植物體某些特定部位，從而形成生長素濃度梯度，植物再對生長素信號的識別、下游生長素相關(guān)基因的表達，最終表現(xiàn)出生理反應(yīng)[22-23]。項目組前期分析不育花和正常花中氨基酸組分時，發(fā)現(xiàn)不育花中的色氨酸明顯高于正常的父本和母本花，分別是父母本的339 %和478 %[14]。推測可能是不育花中的色氨酸不能被轉(zhuǎn)化成生長素，而導(dǎo)致在不育花中積累的結(jié)果。同時，分析茶樹花不育基因的KEGG代謝通路發(fā)現(xiàn)了參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相關(guān)基因包括生長素輸入載體(AUX1/LAX)、生長素反應(yīng)蛋白(AUX/IAA)家族、生長素響應(yīng)(GH3)家族、生長素響應(yīng)因子(ARF)家族以及SAUR家族等基因在不育花中均存在差異表達，說明了不育花中的生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不正常[12]。

4 結(jié) 論

基于上述對茶樹YUCCA10基因的表達特性分析以及前期分析不育花中的色氨酸和生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因。初步推測是由于不育花中YUCCA10基因的表達量低，使依賴于色氨酸的生長素生物合成量少，導(dǎo)致不育花中IAA含量低，影響了生長素信號通道途徑，導(dǎo)致茶花發(fā)育不正常，引起茶花不育。