熒光微球免疫層析技術(shù)定量檢測抗繆勒氏管激素方法的確定

李思慧，林偉強(qiáng)，魏趙延，吳凱

（江蘇正大天創(chuàng)生物工程有限公司，江蘇泰州 225300）

抗繆勒氏管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）又稱為繆勒氏管抑制物（Mullerian inhibiting substance，MIS），是男女性腺功能重要的標(biāo)志，在性腺的發(fā)育過程中起著重要作用。對于男性而言，AMH產(chǎn)生于睪丸支持細(xì)胞，抑制繆勒氏管的發(fā)育，從而產(chǎn)生誘導(dǎo)男性生殖管道[1]；對女性而言，AMH由卵巢的竇前和小竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，其可抑制始基卵泡的啟動，并抑制竇卵泡對卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）的敏感性，對卵泡的發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)[2]。

AMH能在月經(jīng)周期中相對穩(wěn)定存在，且不受激素和避孕藥的影響，其檢測便于臨床應(yīng)用[3-5]。抗繆勒氏管激素水平檢測能更早且準(zhǔn)確地反映卵巢儲備功能，從而預(yù)測絕經(jīng)年齡，同時在卵巢相關(guān)疾病（例如卵巢早衰、多囊卵巢綜合癥、卵巢顆粒細(xì)胞瘤等的診斷）和兒童性別發(fā)育異常的診斷及輔助生殖技術(shù)（ART）中有重要意義[6]。常用的方法有免疫細(xì)胞化學(xué)檢測、放射免疫分析技術(shù)和ELISA檢測技術(shù)，這幾種檢測技術(shù)都有著明顯的缺陷[7]。本文中采用免疫層析技術(shù)與熒光微球標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的方式制備了能定量檢測抗繆勒氏管激素的免疫熒光層析試紙條，兼具膠體金試紙條與熒光標(biāo)記技術(shù)檢測的優(yōu)點(diǎn)，能夠方便攜帶、即時檢測且靈敏度高，便于在基層醫(yī)院進(jìn)行推廣。

1 材料和儀器

AMH抗原、標(biāo)記抗體抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體、捕獲抗體抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體及羊抗鼠IgG多克隆抗體購自杭州博茵生物，硝酸纖維素膜（包被墊）、玻璃纖維素膜（標(biāo)記物墊）、吸水紙、PVC底板購自上海捷寧生物，EuropiumChelate微球購自Bangs/深圳市紐邦生物科技有限公司，各類緩沖液（包括樣品墊處理液、封閉液、保存液、復(fù)溶液、劃膜稀釋液等）試劑均為國產(chǎn)分析純，HM3030型三維劃膜噴金儀購自上海金標(biāo)生物科技有限公司，干式熒光免疫分析儀為蘇州和邁精密儀器有限公司，電化學(xué)發(fā)光法檢測AMH試劑盒來自羅氏。

2 方法

2.1 熒光微球標(biāo)記物的制備

樣品墊預(yù)處理：用XYZ三維劃膜噴金儀將樣品墊處理液噴于玻璃纖維長條上，噴量為4 μL/cm，噴后將玻璃纖維放置于烘箱內(nèi)，干燥溫度37 ℃，過夜干燥。取0.2 μm微球1 mL加入1 mg NHS和1 mg EDC，室溫反應(yīng)3 h，加入300 μg標(biāo)記抗體抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體，反應(yīng)1 h以上。加入90 μL BSA封閉液，反應(yīng)1 h以上。14 000 r/min，4 ℃，離心10 min，棄上清，加入300 μL 0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH=7.4）復(fù)溶沉淀，4 ℃保存。然后用熒光微球標(biāo)記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體溶液噴涂經(jīng)預(yù)處理的樣品墊，噴量為4 μL/cm，噴后將樣品墊放置于烘箱內(nèi)，干燥溫度37 ℃，過夜干燥，干燥結(jié)束后，收集密封保存。

2.2 膜處理

將另一株捕獲抗體抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體及羊抗鼠IgG多克隆抗體分別用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行稀釋，用劃膜噴金儀在NC膜上按照1 mg/mL的濃度進(jìn)行劃膜，含有捕獲抗體抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體的作為檢測線（T線），含有羊抗鼠多克隆抗體的作為質(zhì)控線（C線），然后在37 ℃，濕度＜30%的環(huán)境下過夜干燥，待用。

2.3 組裝

將樣品墊、制備標(biāo)記墊、制備的硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在PVC底板上，切裁制得寬3～5 mm的檢測試紙卡；最后將檢測試紙卡裝入卡殼制得檢測試劑盒。

3 性能評估

3.1 靈敏度實(shí)驗(yàn)

取賦值的AMH企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋配制不同濃度的AMH校準(zhǔn)品（0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL），用制備的抗繆勒氏管激素試紙條進(jìn)行依次測定，每個濃度重復(fù)5次，以0 ng/mL作為空白對照。以抗繆勒氏管激素濃度為橫坐標(biāo)，熒光讀數(shù)儀檢測信號為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2 精密度

抽取3個批次的AMH檢測試紙條，分別用濃度為0.5 ng/mL、4 ng/mL、8 ng/mL的質(zhì)控品進(jìn)行檢測，每個濃度點(diǎn)平行測定15次，計(jì)算3個批號檢測試紙條的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)。

3.3 特異性（交叉試驗(yàn)）

分別用含200.0 IU/L FSH、200.0 IU/L LH的0 ng/mL的AMH液進(jìn)行檢測，了解與AMH有無交叉反應(yīng)。

3.4 穩(wěn)定性

將成品試劑條放置在干燥的庫房中保存，每個月測試濃度為2 ng/mL（±30%）和8 ng/mL（±30%）的企業(yè)質(zhì)控品，測試期為14個月。

3.5 臨床樣本檢測

在醫(yī)院采集50份檢測AMH的全血樣本，用羅氏的電化學(xué)發(fā)光法檢測AMH試劑盒與本試劑盒進(jìn)行比較，對兩種方法檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性和一致性分析。

4 結(jié)果與分析

本試紙條通過將免疫層析技術(shù)與熒光微球標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的手段，利用雙抗體夾心法原理，檢測血清中AMH的濃度，試紙條結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。利用抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體作為標(biāo)記抗體，另兩個抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體作為捕獲抗體，樣本中的AMH首先分別與標(biāo)記的抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體結(jié)合，然后經(jīng)過硝酸纖維素膜的層析作用，與包被在硝酸纖維素膜檢測線上的抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體結(jié)合，樣本中AMH濃度與熒光信號強(qiáng)度成正比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可獲得樣本中AMH的濃度。

4.1 靈敏度

抽取3個批次的AMH檢測試紙條，分別對濃度用0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL的AMH質(zhì)控品進(jìn)行檢測，本試劑盒對0.05 ng/mL的樣品可以部分檢出，對0.1 ng/mL的樣品全部檢出，其最低檢出限≤0.1 ng/mL。由圖2看出，在0.1～20 ng/mL的范圍具有良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.990，T線顏色的深淺與樣品中抗繆勒氏管激素濃度成正比。

圖1 AMH免疫熒光層析試紙條結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.2 精密度

抽取3個批次的AMH熒光微球免疫分析試紙條，分別用濃度為0.5 ng/mL、4 ng/mL、8 ng/mL的質(zhì)控品進(jìn)行檢測，從表1中可以看出批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于15%，說明AMH熒光免疫試紙條的精密度較高。

表1 試紙條精密度分析

4.3 特異性

AMH免疫熒光層析試紙條測得的特異性結(jié)果如表2所示，分別用含200.0 IU/L FSH、200.0 IU/L LH的0 ng/mL的AMH液進(jìn)行檢測，均小于0.1 ng/mL，表明FSH、LH與AMH之間不存在交叉反應(yīng)，本試紙條的特異性強(qiáng)。

表2 試紙條的特異性分析

4.4 穩(wěn)定性

AMH免疫熒光層析試紙條穩(wěn)定性測試結(jié)果如表3所示，在 14個月內(nèi)檢測的濃度為2 ng/mL（±30%）和8 ng/mL（±30%）的企業(yè)質(zhì)控品，各濃度質(zhì)控品的測定結(jié)果的相對偏差均小于20%，表明該AMH試紙條有較好的穩(wěn)定性，該產(chǎn)品有效期大于12個月。

4.5 臨床樣本檢測

用本試紙條和羅氏AMH試劑盒分別檢測50例臨床樣本，分析檢測結(jié)果的相關(guān)性，如圖3所示，回歸方程為Y=0.9957X+0.0019，R2=0.9997，平均相對偏差小于10%，結(jié)果符合臨床分析的要求，適用于臨床檢測。

圖3 AMH測定結(jié)果的相關(guān)性

表3 試紙條的穩(wěn)定性分析

5 討論

AMH檢測在臨床上的應(yīng)用極具意義，目前，AMH是評估卵巢刺激治療效果及預(yù)測卵巢反應(yīng)的理想標(biāo)志物。通過檢測AMH的水平可獲得整個生命周期中卵泡的活性應(yīng)用，靈敏及特異性地預(yù)測卵巢反應(yīng)[8]，指導(dǎo)生產(chǎn)預(yù)后，找出存在卵巢過度刺激綜合征風(fēng)險(xiǎn)女性，并提升體外受精的安全性和有效性。同時為兒童性別發(fā)育異常和卵巢相關(guān)疾病的診斷提供重要的參考依據(jù)，此外，可通過對AMH的檢測預(yù)測絕經(jīng)期，從而為生育能力的保留提供個體化設(shè)計(jì)，幫助制定相應(yīng)的生育計(jì)劃。綜上所述，AMH在臨床診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用[6]。

本研究以熒光微球作為示蹤標(biāo)記物，成功地建立了一種能夠定量檢測AMH 的熒光微球免疫層析試紙條。在試紙條中設(shè)置質(zhì)控線，可增加檢測結(jié)果的可靠性，若C線無熒光信號，無論T線有無熒光信號，其結(jié)果都視為無效。試紙條的最低檢測限最低檢出限≤0.1ng/mL，具有較高的精密度和特異性。穩(wěn)定性檢測結(jié)果表明，連續(xù)14個月內(nèi)檢測兩種AMH質(zhì)控品[2 ng/mL（±30%）和8 ng/mL（±30%）]，各濃度質(zhì)控品檢測結(jié)果的相對偏差均在允許范圍內(nèi)（小于20%），表明試劑盒的有效期大于12個月，與羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測AMH試劑盒相比具有很高的一致性。此外，用該方法檢測AMH，成本低且操作簡單，能夠在社區(qū)基層醫(yī)院中廣泛推廣，而且還能夠滿足大型醫(yī)院內(nèi)因病患流量大而需快速檢測的要求，是一種臨床上檢測抗繆勒氏管激素便捷可靠的方法。