大鼠細小病毒檢測技術研究進展*

吳定宇 呂瑞青 彭 芳

(1. 大理大學實驗動物中心，大理 671003)(2. 成都大熊貓繁育研究基地，成都 610081) (3.大理大學藥學與化學學院，大理 671003)

實驗動物是生命科學研究的基礎和條件。其質量直接影響實驗結果的準確性和可靠性。實驗動物質量控制的核心是對實驗動物攜帶的微生物和寄生蟲進行嚴格控制。

大鼠細小病毒(Rat Parvovirus，RPV)屬于細小病毒科、細小病毒屬，單鏈負鏈DNA病毒，無囊膜，具有多種血清型。該病毒存在于實驗大鼠、野生大鼠和自然環境中，嚴重危害實驗大鼠健康，感染后可造成動物死亡和種群繁殖率下降，造成環境污染。大鼠排泄物和分泌物是主要的傳染源。該病毒同時會污染血清、細胞培養物、胚胎等生物樣品，尤其是該病毒某些毒株可以污染腫瘤細胞系，對腫瘤細胞造成抑制。為控制該病毒傳播，確保實驗動物質量，已建立了RPV的多種檢測方法。本文就目前大鼠細小病毒檢測方法進行綜述。

1 大鼠細小病毒毒株分類

RPV分為三個血清型包括RPV-1(Rat Parvovirus Type 1)，KRV(Kilham Rat Virus)和H-1(Toolan’s H-1)[1]。根據我國實驗動物微生物學檢測的規定[2]， SPF級實驗大鼠須檢測RPV的KRV株和H-1株。國外對RPV分類與檢測范圍和我國不同，美國查爾斯河實驗室(Charles River Laboratories)[3]，指出RPV病毒包括RPV-1，RPV-2(Rat Parvovirus Type 2)，RMV(Rat Minute Virus)，KRV，H-1。歐洲實驗動物學會聯合會(FELASA)[4]要求檢測KRV，RMV，RPV和H-1。具體見表1。

表1 不同國家和地區SPF級實驗大鼠RPV血清型的檢測Table 1 The Serological detection of RPV for SPF rat in different countries and regions

注：●代表檢測

Note：●show detection

1959年Kilham和Olivier[5]發現在大鼠腫瘤細胞系中存在一種污染性物質，經分離發現該污染物為病毒，并稱為Kilham rat virus(KRV)或Rat Virus(RV)。1960年Toolan等[6]總結前人研究，通過移植人類腫瘤的無細胞(Cell-free)游離成份，會導致倉鼠出現病變，認為這種可濾過性因子是病毒引起的，并從大鼠中分離該因子，移植到人肝癌細胞1(HEp-1)中，最終鑒定為病毒，這種病毒稱之為Toolan病毒，通常稱之為H-1病毒。

1998年Ball-Goodrich等[7]發現了一種新的大鼠細小病毒PRV-1，通過克隆、DNA序列分析來與其他細小病毒進行比對發現，PRV-1的編碼衣殼蛋白的VP1序列和其他細小病毒的VP1序列相似度不超過69%，這就解釋了PRV-1的抗原差異性。同時，Ball-Goodrich進行抗體檢測分析發現，其有別于KRV和H-1不同的血清型，是第三種血清型。2002年Wan等[8]發現了之前三種大鼠細小病毒不同的RMV毒株，分別是RMV-1a,RMV-1b,RMV-1c,通過基因組核苷酸序列分析和蛋白質氨基酸序列預測的方法，發現三種RMV毒株它們有著共同的啟動子和剪切區域，轉錄起始密碼子和終止密碼子，它們基因序列的同源性約97%，氨基酸序列的相似性約95%，RMV與KRV和H-1的基因序列差異性小，但是與PRV-1存在較大差異。通過HAI試驗發現，RMV有著與KRV、H-1和RPV-1不同的血清型。

2 大鼠細小病毒檢測方法

2.1 毒株分離與鑒定

對疑似感染細小病毒的大鼠進行組織取材，取材部位根據可能感染毒株的不同而不同。將取材的組織進行培養，獲取上清液，用濾膜過濾，濾過液接種特定細胞進行培養，然后進行病毒檢測，如動物回歸實驗、分子生物學鑒定、血清學鑒定等。

國外一般采用NB-324 K細胞對H-1毒株進行分離培養[9-11],如Leuchs等在研究如何高質量大規模純化生產H-1毒株時，采用由SV40轉化的新生兒腎細胞NB-324 K，來提高H-1作為DNA病毒的復制擴增能力。對KRV株一般采用DMEM培養基培養大鼠腎細胞(NRK細胞)[12-13]，KRV病毒在NRK細胞上會形成吞噬斑，所以可以通過病毒空斑實驗檢測KRV毒株。

劉先菊等[14-15]分別建立了大鼠細小病毒KRV株和H-1株的細胞培養方法。采用大鼠膠質瘤細胞系(Rat glial cell line C6)培養大鼠細小病毒KRV和H-1，待細胞病變達到測定標準后，進行FITC鑒定所培養病毒的抗原，用HA測定培養物上清效價，用DNA測序鑒定所培養病毒，結果發現采用C6細胞系可以大量培養KRV和H-1。

2.2 血清學檢測

血清學檢測是診斷和鑒定病毒的重要方法之一。我國實驗動物標準規定了四種方法用于大鼠細小病毒的檢測[2]：血凝抑制試驗(HI)、免疫酶試驗(IEA)、免疫熒光試驗(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。

吳小閑等[16]采用HI方法檢測大鼠細小病毒RV株(也稱KRV)和H-1株，均發現存在陽性感染的情況。賀爭鳴等[17]采用ELISA、IEA和HI這三種方法進行比較，檢測了大鼠細小病毒RV株，發現ELISA和IEA在重復性和抗體陽性檢出率方面均優于HI(P<0.05)。王翠娥等[18]采用ELISA方法對2012年至2013年國內36家單位的大鼠和小鼠血清進行病毒抗體檢測，檢測出來的陽性樣品再用免疫熒光試驗(IFA)進行復檢，大鼠細小病毒檢測項目按照查爾斯河實驗室的檢測項目進行，發現大鼠細小病毒毒株RPV、H-1、KRV、RMV均呈陽性。李曉波等[19]報道，在16個實驗動物質量檢測實驗室進行比對中，14個實驗室采用ELISA，占87.5%，3個實驗室采用IFA方法，另有1個實驗室同時采用IFA和ELISA方法。目前，對大鼠細小病毒進行檢測的進口ELISA試劑盒一般采用Charles River、Biotech Trading Partners、XpressBio Life Science等公司產品。國產ELISA大鼠細小病毒檢測試劑盒主要采用中國食品藥品檢定研究院產品。付瑞等[20]建立了H-1細小病毒抗體ELISA檢測方法，經試驗發現與大鼠KRV病毒有交叉反應。

不同國家或地區檢測大鼠細小病毒毒株類型不同，初檢和復檢的方法也有所差異。如美國查爾斯河實驗室的動物診斷研究服務部[21]對近五年北美地區和西歐(主要是法國)的大鼠和小鼠流行病學情況進行研究。共收集了50萬份小鼠樣品和8萬份大鼠樣品。采用血清學方法檢測大鼠細小病毒(病毒毒株為KRV、RMV、H-1和RPV)。初步檢測采用多重免疫熒光方法(Multiplexed Flurometric Immuneno Assay，MFIA)或ELISA，對于檢測出的陽性樣品復檢采用IFA或HAI，具體見表2。

表2 SPF級大鼠細小病毒血清學檢測(查爾斯河實驗室)Table 2 The Serological detection of rat parvovirus for SPF rat in Charles River Laboratories

Manjunath等[22]對印度26個實驗動物機構的大鼠和小鼠進行了血清學調查，每個機構分別采集5份大鼠和5份小鼠血樣，在130份大鼠血樣中用ELISA方法檢測大鼠細小病毒KRV株和RPV株，發現RPV感染率在5.38%，KRV無感染。Mcinnes等[23]在2004年到2009年間從澳大利亞、新西蘭和新加坡等國家的大學、研究中心、科研機構獲取SPF級的大鼠和小鼠，采用過量CO2安樂死，在收集的血清和組織樣品中檢測出大鼠細小病毒，毒株包括H-1，KRV，RMV和RPV。檢測方法為首先進行ELISA檢測，對于ELISA檢測結果不確定或可疑的，再用IFA進行重測。Liang等[24]、 Zenner和Reqnault[25]以及Schoondermark等[26]對不同國家或地區大鼠和小鼠進行病毒流行調查和血清學篩查，均采用ELISA作為大鼠和小鼠細小病毒的首選檢測方法。

綜上所述，國內外實驗室在檢測大鼠細小病毒毒株種類上存在差異，但普遍采用血清學檢測方法，ELISA使用最多。對于某些血清樣品結果的不確定性，通常采用IFA或HAI進行復檢，以對檢測結果進行確認。

2.3 分子生物學檢測

采用普通PCR檢測大鼠細小病毒，如Besselsen等[27]采用PCR技術來檢測H-1和KRV毒株，通過設計引物來擴增H-1和KRV編碼衣殼蛋白的VP基因為目的片段。Wan等[28]采用PCR檢測RPV和RMV病毒，設計引物分別擴增RPV的NS區序列和RMV的VP區序列目的基因。

除普通PCR方法之外，我國學者還采用多重PCR方法進行大鼠細小病毒的分子生物學檢測。李曉波等[29]建立對大鼠H-1和KRV毒株檢測的雙重PCR方法，分別設計特異性引物，擴增目的片段是病毒的衣殼蛋白基因編碼區(VP)，并確定2對引物無交叉反應，實驗結果發現能夠高效檢測大鼠細小病毒的感染。饒丹等[30]根據大鼠細小病毒基因特異性，采用雙重PCR的方法，來檢測H-1、KRV、RMV和RPV四種大鼠細小病毒，在VP2基因篩選一對用于特異擴增RPV毒株的引物，在NS1基因設計一對用于擴增H-1、KRV和RMV的引物，敏感實驗表明，雙重PCR的最低檢測限可達1 000拷貝/μL。

以高通量測序方法為基礎，可以進行不同毒株的大鼠細小病毒檢測。傳統的基因測序技術采用Sanger法，存在成本高、耗時及測序樣品受限等不利因素，Life Sciences公司發明了高通量測序技術又稱第二代測序技術(next generation sequencing,NGS)可以對上百萬DNA分子進行測序檢測。查爾斯河實驗室已經開展了商業化高通量試驗—檢測DNA病毒服務。H?fler等[31]針對嚙齒類實驗動物存在的病毒、細菌的監控，開發出一種新的高通量多重PCR分析方法，稱之為rDVF(rodent DNA virus finder)，可以同時鑒定24種大鼠和小鼠DNA病毒感染情況，其中大鼠細小病毒包括H-1、RPV、KRV和RMV。

Luminex液相芯片分析技術可進行多種微生物和病毒的檢測，其技術包括xMAP技術和xTAG技術。xTAG技術使用專有通用標簽系統，易于進行優化和核酸檢測開發，Luminex公司所提供的基于xTAG技術的核酸檢測，包括感染性疾病和基因檢測相關的臨床診斷檢測。如對多種腸道病原體和呼吸道病毒均可以采用xTAG技術進行檢測[32-33]。Xu等[34]發明一種陣列式xTAG檢測方法，可同時檢測大鼠細小病毒KRV、H-1、RPV和RMV，并對這四種毒株予以區別，通過xTAG技術和常規PCR技術檢查了50個臨床樣品，結果顯示高度一致。

3 結語

病毒分離培養和觀察鑒定被認為是病原微生物檢測的“金標準”(Gold Standard)，但缺點是檢測周期長，速度慢，對操作要求較高且成本也高。

血清學檢測是現行的實驗動物國家標準規定的方法，目前各實驗室普遍采用ELISA進行大鼠細小病毒初篩，復檢時用IFA或HIA進行。雖然ELISA和IFA檢測敏感性好，但是由于大鼠細小病毒毒株的非結構蛋白相對保守，導致抗體會產生交叉反應，因此ELISA和IFA檢測的特異性較差，不易將不同毒株的細小病毒區分開來。HIA檢測有一定特異性，但由于其只針對抗體直接作用于不同毒株的血細胞凝集素上，形成血凝抑制反應，因此敏感性較低。

以PCR為主的分子生物學技術具有高效、快速、靈敏的優點，但該技術也存在有假陽性和假陰性的缺點。目前該技術及衍生技術廣泛應用于國內外嚙齒類實驗動物病毒檢測中。多重PCR及液相芯片分析技術等方法可以快速區分不同毒株的大鼠細小病毒。

細小病毒是嚴重影響實驗大鼠健康的病毒之一，因此建立起靈敏、準確、操作方便的檢測方法，是準確檢測和有效控制該病毒傳播的重要手段。