新生鼠壞死性小腸結腸炎模型建立方法的改進及評價*

席世兵 楊 敏 謝集建 景衛利 李興朝 李 濤

(湖北省十堰市太和醫院兒童醫療中心兒科2病區，十堰 420000)

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

低體質量兒配方奶粉(特別能恩)由雀巢公司提供；脂肪乳注射液(C14～C24)由華瑞制藥有限公司提供；湯臣倍健蛋白質粉購自朗臣健益公司；LPS(E．coli 055：B5)購自美國Sigma公司；喂養管由一次性使用靜脈留置針(青島，威高)改裝；ZKY-4F智能控氧儀、XBS-01多功能小白鼠試驗箱(杭州愛普儀器設備有限公司)；保育箱由HW-1000超級恒溫水浴箱改裝(成都泰盟科技有限公司，成都)；SM-3B手術顯微鏡(美國 AmScope公司)；尼康D5100照相機(日本，尼康)。

1.2 實驗動物

SPF級出生2 h內未開奶新生SD大鼠90只，生產許可證:SYXK(E鄂)2011-0031,購自湖北醫藥學院動物中心。

1.3 方法與分組

1.3.1分組：將體質量(5.6～8.5) g新生大鼠采用隨機數字表法分組。分為5組，對照組10只，實驗組每組20只。A組與代母鼠同籠鼠乳喂養，且未行任何干預；B 組人工喂養+缺氧冷刺激+LPS灌胃(5 mg/kg)；C組人工喂養+缺氧冷刺激+LPS灌胃(10 mg/kg)；D組人工喂養+缺氧冷刺激+LPS腹腔注射(2 mg/kg)；E組人工喂養+缺氧冷刺激+LPS腹腔注射(5 mg/kg)。

1.3.2鼠乳代乳品的配置及人工喂養：B、C、D、E組新生大鼠出生后即置于自制的保育箱內(溫度 37 ℃；濕度 45%～55%)，采用代乳品人工喂養，代乳品參考Auestad[1]研究報道配制，每100 mL代乳品添加早產兒奶粉1.6 g，加朗蛋白粉8.7 g，脂肪乳48 mL，總熱量約581 kJ，最終成分及熱量如表1所示。喂養方法參考文獻[2]并適當改進，采用1 mL注射器連接威高靜脈留置針作為喂養管，沿新生大鼠一側口角緩慢、輕柔插入約會厭水平(深度0.8～1.0 cm)，當新生鼠出現張口、吞咽動作時，緩慢注入代乳品每4 h給予代乳品約0．1 mL/次，每12 h增加0.05 mL，第2天增至0．3 mL/次，72 h后，停止缺氧冷刺激，繼續喂養12 h、取材。

表1 鼠乳成分及代乳品成分Table 1 Rat milk and simulated milk ingredients

1.3.3缺氧及冷刺激：實驗組新生大鼠首次代乳品喂養后1 h，預設ZKY-4F智能控氧儀氧濃度為0%～0.5%，打開氮氣罐閥門及流量表，控制氮氣流量在5 L/min左右，待箱內氧濃度<0.5%，將新生大鼠置入缺氧箱內，缺氧7 min，轉置于4 ℃冷藏室7 min，D、E組在冷刺激結束后分別接受2 mg/kg、5 mg/kg LPS(LPS均溶于0.1 mL生理鹽水)，注射結束后將所有新生鼠放回保育箱復溫，上述操作每隔12 h一次，連續3 d。

1.3.4標本收集：正常對照組及實驗處理組新生鼠在末次處理后12 h或自然死亡后，立即打開腹腔取近回盲部小腸3 cm，近回盲1 cm置于4%甲醛中固定，剩余 2 cm腸管置液氮中儲存備用做生化分析。

1.3.5組織病理學檢查：近回盲部小腸于4%甲醛溶液中固定24 h以上，脫水、石蠟包埋，取冠狀面、5 μm切片，HE染色后在光鏡下觀察各組織的形態學改變。參照文獻[3]的病理評分標準對回盲部進行腸組織損傷評分：0分：腸黏膜絨毛完整，結構正常；1分：絨毛輕度水腫，上皮脫落僅限于絨毛頂部；2分：絨毛中部損傷壞死；3分：絨毛缺失，隱窩仍可識別；4分：黏膜上皮結構完全缺失，或透壁壞死。以取樣品中觀察到的最高分數確定為腸道的損傷程度，組織學評分≥2分確認為NEC。

1.3.6炎癥因子檢測： 根據試劑盒說明書操作方法，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測各組新生鼠小腸組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.4 統計方法

用SPSS 20．0軟件處理數據，計數資料采用單因素多組方差分析，多樣本等級資料采用kruskal-wallis秩和檢驗結合Nemenyi法檢驗做兩樣本間分析，各組鼠存活情況采用Kaplan-Meier法進行生存分析；P

2 結果

2.1 一般狀況及生長狀況

A組活動度良好，進食及排便皆正常，無腹脹及腹瀉，體質量增加良好；B、C、D、E組在缺氧過程中，均有呼吸困難，紫紺，抽搐及大小便失禁。B、C組造模后新生鼠均出現活動減少，反應稍遲鈍，體質量減輕、腹脹腹瀉，排黃綠色黏液便甚至血便情況。其中，D組大鼠注射LPS后約60～120 min出現抖動、精神萎靡，活動減少，6～12 h后開始腹脹、腹瀉，活動減少，體質量減輕。E組在LPS注射后30 min左右出現煩躁、尖叫、黏膜蒼白、晦暗，進而活動減少、萎靡，活動遲緩，4～6 h出現腹脹、黃綠稀便或黑便，3 h開始陸續出現實驗鼠自然死亡。

2.2 生存狀況及體質量變化情況

根據各組實驗鼠存活情況，通過生存分析顯示，實驗組較對照組均存在差異(P<0.05),B、C、D組間生存差異均無統計學意義(PBC=0.68、PCD=0.44、PBD=0.24)，但D、E組間生存差異有統計學意義(P=0.04)，大劑量LPS(5 mg/kg)腹腔注射較小劑量LPS(2 mg/kg)腹腔注射可顯著增加實驗鼠的死亡率(P<0.05)。A至E組NEC發病率分別為0/10、25%(5/20)、35%(7/20)、75%(15/20)、80%(16/20)，死亡率分別為：0/10、15%(3/20)、20%(4/20)、35%(7/20)、60%(12/20)。對死亡新生鼠解剖、取材、病理評分，若NEC病理評分≥2分，認為是NEC相關性死亡，<2分認為是其他非NEC相關性死亡， A、B組均無非NEC相關性死亡；C、D、E組分別有1、2、5只出現非NEC相關性死亡。除A組外，實驗組新生鼠均有不同程度體質量減輕，除B、C組間體質量減輕無差異外， C、D、E組間體質量減輕均有明顯差異(見圖1)。

2.3 腸組織病理改變

顯微鏡下可見正常大鼠腸道空腸呈乳白色、回結腸為淡黃色，紅潤有光澤；腸管輕度擴張、充血；腸壁積氣變薄，呈紫黑色，輕度腹水；腸管大量積氣，發黑、壞死，穿孔、變脆、大量腹水(如圖2A～E)；根據HE染色結果進行病理評分：圖2F至J分別代表0分、1分、2分、3分、4分。

2.4 病理評分結果

采用盲法由3名研究人員對NEC標本進行病理評分，評分不一致者，再由第4名研究人員介入討論確定病理評分。評分結果如圖1C，采用Kruskal-WallisH檢驗提示5組間差別有統計學意義(P<0.001),進一步采用Nenmenyi法檢驗提示實驗組間NEC病理評分均無顯著性差異(P>0.05)。

2.5 小腸組織內炎癥因子變化

建模后測得各組實驗鼠小腸組織中腫瘤壞死因子-α結果(如圖1.D)，結果顯示LPS經胃腸道給藥組，不同劑量組間較對照組，TNF-α水平差異性顯著(P<0.05)；經腹腔注射給藥組，大劑量組較小劑量組小腸組織內TNF-α水平差異也較顯著(P<0.05)，提示高劑量組系統性炎癥反應更重。

圖1 生存狀況及體質量病例損傷程度及小腸組織內腫瘤壞死因子α濃度變化情況注：A：實驗鼠生存分析大劑量LPS腹腔注射組生存率顯著降低(P<0.05)；B： 實驗前后新生鼠體質量變化，正常對照組體質量增加 良好，但NEC模型組體質量顯著降低(P<0.05)；C：病理學評分及統計結果 實驗組損傷程度較正常組顯著增高，但LPS口服組間無 顯著差異，LPS腹腔注射組間無顯著差異(P≥0.05)；D：小腸組織中TNF-α濃度 實驗組較對照組顯著升高，LPS經腹腔注射組 較口服組小腸組織中TNF-α水平顯著較高(P<0.05)，且TNF-α升高水平與LPS劑量呈正相關。Fig.1 The survival analysis (A), change of body weight (B), pathogenic score(C) TNF-α concentration in intestine(D)Note：A：The survival rate of Group E (large-dose LPS intraperitoneal injection) is decreased significantly (P<0.05)，but difference between Group B, Group C and Group D were not significant (Fig1A)；B：The change of body weight during study.The body weight obtain in Group A is normal, but the decrease of body weight in NEC model(Group B, C, D and E) was significant (P<0.05)； C：The pathological scores of intestinal injury is increased significant in experimental groups(P<0.05),but the differences between Group B and Group C, Group D and Group E are not significant；D：The TNF-α concentration in intestine between control and trail groups were significant(P<0.05), LPS intraperitoneal injection higher than oral administration, the TNF-α concentration is positive corrective with the dose of LPS(P<0.05).

圖2 不同病理損傷程度的典型實體圖及HE染色圖(HE染色 ×200)注： A：0分，腸管呈粉紅色、有光澤，瑞蠕動良；B：1分，輕度粘膜下腫脹和絨毛輕度受損；C：2分，腸管擴張，嚴重梗阻，腸壁積氣； D：3分，腸管嚴重擴張，黑死；E：4分，嚴重壞死、腸穿孔、腹水；F：腸黏膜絨毛完整，結構正常；G：上皮脫落僅限于絨毛頂部； H：絨毛中部以上損傷壞死；I：絨毛缺失，隱窩仍可識別；J：黏膜上皮結構完全缺失，或透壁壞死Fig.2 Typical characteristics of gross morphology and HE staining (0, 1, 2, 3, 4 points)Note：A：NEC score 0, The normal intestinal tract was carnation and glossy, intestinal canal moved actively; B：1, Slightly congested disclosed; C：2, Sight dilatation, severe congested; D：3, Extensive dilatation, appeared black；E：4, Severe necrosis, extensive discoloration; F：NEC score 0, normal ileum; G：1, slight submucosal separation and villus tip injury; H：2, villas failed off; I：3, mucosa grew swelling and villus sever injury, severe separation of submucosa and/or lamina propria edema in submucosa; J：4,transmural necrosis

3 討 論

新生兒壞死性小腸結腸炎(NEC)是新生兒期常見的致死性疾病。自1967年首次報道并被普遍認識以來，盡管圍產醫學取得了很大發展，早產兒成活率明顯提高，但NEC的發病及預后仍無明顯改善。目前，出生體質量在500～1 500 g之間的新生兒NEC的發病率高達7%，NEC相關死亡率達20%～30%，嚴重NEC需手術治療的患兒死亡率更高[4]。目前研究認為早產、不適當的胃腸喂養、缺氧缺血損傷及腸道菌群失調、移位導致腸道異常的免疫反應是NEC發病的關鍵環節[5]。NEC的確切病因、病理機制仍不明確，亟需進一步研究。

動物模型在NEC病因及病理機制的研究中起著非常重要的作用，許多學者探索不同的NEC模型建立方法，但該模型建立方法至今仍不統一[6]。人工喂養、缺氧、復氧、冷刺激、LPS等單一的建模方法穩定性、可重復性較差；而綜合早產、人工喂養、缺氧冷刺激、LPS灌胃或腹腔注射的造模方法應用越來越普遍[7]。但各研究報道在缺氧時間(3～10 min)，4 ℃冷刺激時間(5～10 min)、LPS用法(經胃腸道、腹腔注射)用量(2～10 mg/kg)方面仍存在較大差異[8-10]。故本實驗參考目前普遍應用的建模方法，進一步改進、比較不同建模結果，以期優化建模條件。

新生大鼠是NEC模型最常用的實驗動物，屬“晚發育性動物”，1日齡新生鼠相當于22～24周早產兒、3日齡相當于28～32周早產兒發育水平[11-12]，故推測新生鼠可以模擬早產兒建立NEC模型，本實驗鼠采用出生2 h內未開奶新生SD大鼠作為實驗鼠。喂養方面，新生鼠，尤其是早產鼠，食管插管灌胃操作難度極大，食管穿孔、氣胸、胃穿孔等并發癥發生率高，預實驗中發現，食管插管明顯增加實驗鼠的死亡率。故本實驗在此基礎上做適當調整，利用喂養管刺激新生鼠口咽部，引出新生鼠的吞咽反射，緩慢注入代乳品，可達到喂養目的，同時可減少新生鼠因喂養所致的非NEC相關性死亡，提示試驗的穩定性。

最新研究認為TLR4作為LPS受體，可促進異常強烈的嚴重反應、誘導腸上皮細胞自噬、凋亡并抑制其增殖、遷移繼而抑制小腸損傷修復能力，在NEC的發病過程中發揮著關鍵性作用[8, 10, 13]， LPS在NEC模型建立中的應用得到認可并普遍應用。但其用法、用量并不統一，本實驗比較人工喂養、缺氧冷刺激結合口服或腹腔注射兩種常用不同劑量LPS的造模方法，經胃腸道組(B、C)之間在死亡率、NEC發病率、NEC評分方面，差異并無統計學意義。D、E組比較發現，LPS 5 mg/kg腹腔注射，新生鼠在3～6 h開始出現煩躁、尖叫，繼而全身皮膚黏膜蒼白、青紫等嚴重膿毒血癥癥狀，且12 h內死亡率為3/20，解剖后病理證實NEC評分均小于2分，故認為非NEC相關性死亡；既往有研究也發現，注射LPS(5 mg/kg)可導致大鼠肝、腎、肺出現嚴重的出血壞死，導致實驗鼠直接死亡[14]，本試驗B、C、D組中新生鼠非NEC死亡分別為1、2、5只，雖無統計學差異(PDE=0.2)，但不排除受樣本量較小的影響；綜合分析認為LPS高劑量腹腔注射，可能誘發全身性炎癥反應綜合征(SIRS)、肺出血、多器官功能衰竭(MODF)，而NEC病變尚未充分顯現，增加了非NEC致死率，導致NEC發生率及NEC病理評分呈“假性降低”，故D、E組間病理評分無差異，但死亡率(P=0.027)、生存分析(P=0.04)結果顯示兩組間差異有統計學意義,結果提示增加LPS腹腔注射劑量并不能提高NEC 的發病率，而且由此誘發的并發癥可能增加實驗鼠的死亡率。

通過生存分析、NEC發生率、NEC相關性死亡率、NEC非相關性死亡率、NEC病理評分、小腸內炎癥因子變化方面綜合分析，認為新生鼠結合人工喂養、缺氧冷刺激、小劑量(2 mg/kg)LPS腹腔注射是建立NEC較為理想的方法。在NEC模型建立及試驗結果分析過程中應該重點評價小腸病理性損傷程度，同時納入實驗鼠的生存情況綜合性分析，盡可能防止假陰性或假陽性結果出現。

目前壞死性小腸結腸炎的病因及病理機制仍不完全,不明確，部分研究認為消化系統黏膜屏障損傷后繼發性感染和膿毒血癥是主要的病理過程[15]，但目前所有的動物模型建立方法主要通過系統性刺激而建立腸壞死病變，經消化道給予LPS的結果穩定性較差，成功率較低，隨著對NEC病理生理機制研究的不斷深入，改模型的建立方法應需要進一步改進和完善，以更好地模擬臨床病例生理過程。