一過性食管下括約肌松弛動物模型的建立及其機制探討

朱海燕 張咩慶

[摘要] 目的 建立一過性食管下括約肌松弛（TLESR）的大鼠模型并探討其發生機制。 方法 SD雄性大鼠隨機分為4組：空白對照組、模型組、藥物（saclofen）注射組、空白注射組，每組12只。通過逐次向胃內注水的方法建立胃擴張誘發TLESR的動物模型。藥物注射組和空白注射組在進行胃擴張30 min前，用微量注射法往孤束核區注射GABAB受體阻斷劑saclofen或改良Riger液。采用消化道動力檢測系統檢測、分析TLESR頻率，采用免疫組織化學法觀察孤束核區GABAB受體表達。 結果 模型組大鼠TLESR頻率提高，GABAB受體表達減少，向孤束核區微量注射GABAB受體阻斷劑可大幅提高TLESR頻率。 結論 提示胃擴張造模成功，TLESR的發生與孤束核中GABAB受體調節密切相關。

[關鍵詞] 一過性下食管括約肌松弛;造模;胃擴張;GABAB受體

[中圖分類號] R571? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）04-0035-04

[Abstract] Objective To establish a rat model of transient lower esophageal sphincter relaxation（TLESR） and explore its mechanism. Methods SD male rats were randomly divided into 4 groups： Blank control group， model group， drug（saclofen）injection group and blank injection group， with 12 rats in each group. An animal model of gastric expansion induced TLESR was established by successively injecting water into the stomach. The drug injection group and the blank injection group were injected with the GABAB receptor blocker saclofen or modified Riger solution into the solitary nucleus region by microinjection before the gastric dilation was performed for 30 min. The frequency of TLESR was detected and analyzed by digestive tract dynamic detection system， and the expression of GABAB receptor in the solitary nucleus was observed by immunohistochemistry. Results In the model group， the frequency of TLESR increased and the expression of GABAB receptor decreased. Microinjection of GABAB receptor blocker into the solitary tract nucleus region could significantly increase the frequency of TLESR. Conclusion It is suggested that the gastric dilatation model is successful， and the occurrence of TLESR is closely related to the regulation of GABAB receptor in the solitary tract nucleus.

[Key words] Transient lower esophageal sphincter relaxation; Modeling; Gastric dilatation; GABAB receptor

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是臨床常見疾病，我國近年來本病患病率在逐年升高[1]。一過性食管下括約肌松弛（transient lower esophageal sphincter relaxation，TLESR）被認為是其發病根本病因[2]。TLESR是指與吞咽無關的食管下括約肌自發性松弛[3]，伴隨食管下括約肌壓力（low esophageal sphincter pressure，LESP）突然降低，其松弛時間可持續10～45 s，明顯長于吞咽時食管下括約肌松弛時間（6～8 s），且降低≥5 mmHg。查慧等[4]研究發現健康人中有35%的TLESR伴隨胃食管反流，而GERD患者中有65%的TLESR伴隨胃食管反流，發生率明顯高于健康人。所以對于GERD的研究，不管在臨床還是在基礎研究中，如何抑制TLESR逐漸成為很多學者的關注點。既往有研究表明TLESR在進食、胃擴張時易發生，其發生機制可能與迷走神經興奮有關，有研究顯示將犬頸部迷走神經冷凍可完全阻斷TLESR[3]。腦干孤束核作為迷走神經中樞接受胃擴張等引發的神經沖動，作用于食管下括約肌，在引發TLESR的過程中可能起重要作用[4]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutiric acid，GABA）作為廣泛存在于中樞神經系統中的抑制性神經遞質，孤束核中也存在大量GABA能神經元及GABAB 受體。對孤束核內GABA能神經末梢的超微結構研究顯示GABAB受體和外周傳入末梢有緊密的聯系[5]。雖然研究表明，調節孤束核中GABAB受體可影響迷走神經機械感受器，改變迷走神經傳出沖動[6]，但其在引發TLESR中作用尚不明確，本研究旨在探討腦干孤束核中GABAB受體在胃擴張模型大鼠發生TLESR中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠48只，體重350～400 g，平均2.5月齡，均由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK（滬）2013-0016]提供，隨機分為4組：空白對照組、模型組、藥物注射（saclofen）組、空白注射組，每組12只。該實驗在浙江中醫藥大學動物實驗研究中心完成[SYXK（浙）2013-0184]。

1.2 實驗方法

1.2.1 胃擴張誘發TLESR模型? 大鼠予10%水合氯醛（0.35 mL/100 g 體重）腹腔注射麻醉（禁食10 h）后，予輕柔地插一端套有薄膜囊的聚乙烯軟管入胃，深度為下食管括約肌下4 cm，向氣囊內注水，給予胃內壓≥5.32 kPa（40 mm Hg）壓力的時相性胃擴張（注水2 min，間歇4 min，交替進行，6 min為1輪，共10輪）[7，8]。

1.2.2 孤束核內微量注射針的埋入? 大鼠腹腔注射麻醉后，固定于立體定向儀上，切開大鼠頭部皮膚，暴露骨縫，參照 LJ.Pellegrine 鼠腦定向圖譜，顱骨鉆孔，埋植不銹鋼套管（外徑0.5 mm，內置直經0.3 mm的不銹鋼絲，其下端比套管長0.5 mm），微量注射時，將不銹鋼絲內芯拔出，微量注射針超出外套管1 mm，用于局部微量注射。

1.2.3 實驗流程? 將適度麻醉的大鼠仰臥固定于實驗臺上，采用消化道動力檢測系統（型號：GAP-08A），經口插入測壓管，使遠端3個通道均置于胃內，開始記錄測壓數據。采用定點牽拉法（每15秒向外牽拉測壓管10 mm）勻速牽拉測壓管直至第2（或含第3）通道顯示位于LES內時，將測壓管固定于動物口邊。此時，第1通道位于胃內，第2（或含第3）通道位于LES，檢測并分析TLESR的發生頻率。空白對照組：不給予任何處理。胃擴張模型組在進行胃擴張的同時開始測壓。藥物（saclofen）注射組和空白注射組在進行胃擴張30 min前，微量注射針連接微量注射泵，以1 μL/min 的速度向孤束核區注射1 μL的Saclofen（美國Sigma公司）或改良Riger液，注入時程為1 min，30 min后進行胃擴張的同時開始測壓。

1.2.4 樣本制作? 用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，麻醉后開胸，向左心室灌注生理鹽水沖洗至右心房流出的液體變清，再用4%多聚甲醛溶液快速灌注固定，之后繼續緩慢固定30 min，斷頭取延髓界溝的外側（孤束核），標本浸泡于4%多聚甲醛溶液6 h，然后于4℃時用15%蔗糖溶液脫水24 h，再于4℃用30%蔗糖溶液脫水48 h，標本全部沉至容器底部，取出標本，用錫箔紙包裹密封，液氮迅速冷凍。于恒溫冷凍切片機內連續冠狀位冰凍片，片厚20 μm。

1.3檢測指標

TLESR發生檢測系統：消化道動力檢測系統（型號：GAP-08A）檢測。TLESR的判定標準：LES從開始松弛到完全松弛的時間≤10 s;LES的最低壓力應≤2 mmHg。此外，對于壓力≤2 mmHg，松弛時間≥10 s的LES 松弛，且可以除外是由于多次快速吞咽所致可以被認為是TLESR。免疫組化法檢測孤束核區GABAB受體的表達：將上述制作好的樣本在電鏡下觀察免疫組織化學染色切片。選擇3個200倍視野，通過顯微鏡拍照，采集分析樣本相關部位，計算陽性細胞的總面積。

1.4 統計學方法

實驗數據資料用SPSS19軟件進行統計分析，TLESR頻率、GABAB受體陽性面積測定值用（x±s）表示，進行單因素方差分析，組間數據比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠TLESR頻率結果

2.2 各組大鼠孤束核區GABAB受體免疫組化染色結果

與空白對照組相比，模型組GABAB受體陽性面積明顯減少，差異有統計學意義（t=12.53，P<0.01）;與空白注射組相比，藥物注射組GABAB受體陽性面積較高，差異有統計學意義（t=2.48，P=0.03），見表2、封三圖7。

3 討論

TLESR是近年來發現的胃食管反流病發病的主要機制之一，主要有以下特征：（1）與吞咽無關的LESP突然降低或接近胃內壓的水平（≥5 mmHg）;（2）LES松弛前4 s和后2 s無咽部吞咽信號;（3）其發生時間持續長于吞咽誘發的LES松弛時限，持續約10～45 s，吞咽誘發的LES松弛時限多為6～8 s;（4）缺乏食管體部的蠕動收縮。有研究表明，胃底膨脹、胃排空遲緩會增加TLESR的頻率，是胃食管反流發生因素之一[9]。根據這一系列理論，結合既往相關實驗經驗[10]，本研究組利用大鼠胃內注氣進行胃擴張來誘發TLESR，同時采用低順應性毛細管灌注測壓系統記錄、分析TLESR發生頻率。試驗期間模型組大鼠的TLESR發生頻率明顯高于空白對照組，表明胃擴張誘發TLESR模型大鼠造模成功。

既往研究表明，γ-氨基丁酸B受體（γ-aminobutyric acid B receptor，GABAB-R）在調控TLESR相關迷走神經信號傳導的過程中發揮著重要的作用。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是中樞及外周神經系統中重要的抑制性神經遞質，通過介導下游的GABAA和GABAC受體以及代謝型GABAB-R發揮生理功效。其中GABAB-R大量存在于迷走神經中樞孤束核中，參與中樞神經系統中多種神經活動并發揮重要功能[11]。孤束核是腦干內接受內臟初級感覺傳入信息的重要核團，接受由迷走神經傳入的胃擴張等引發的感覺信號，調控食管下括約肌，在引發TLESR的過程中起重要作用[12]。對孤束核內GABA能神經末梢的超微結構研究顯示GABAB受體和外周傳入末梢有緊密的聯系[13]，調節孤束核中GABAB受體可影響迷走神經機械感受器，改變迷走神經傳出沖動[6]。既往在動物實驗中也發現GABAB-R激動劑Baclofen可以影響食管下括約肌壓力，減少酸與非酸反流[14]。臨床研究也得出類似的結論，在健康志愿者和胃食管反流病患者中均發現Baclofen可以明顯減少可明顯減少24 h 的胃食管反流并增加食管pH[15，16]。因此本研究組推測孤束核中GABAB-R在孤束核對于食管下括約肌的調節中扮演了重要角色，參與迷走神經-食管中樞調控機制，與TLESR的發生存在一定關系。為了證實該推測，本研究組應用孤束核內微注射GABAB受體拮抗劑saclofen對胃擴張誘發TLESR模型大鼠進行預處理以觀察GABAB受體對TLESR發生的控制作用。結果發現，GABAB受體拮抗劑saclofen組較空白注射組的TLESR發生頻率大幅上升，說明GABAB受體調節與TLESR的發生密切相關。進一步的免疫組化染色結果顯示，模型組大鼠與空白對照組大鼠比較，孤束核中GABAB受體表達下調，兩組間差異存在顯著性意義，與此同時，模型組大鼠相較于空白對照組大鼠的TLESR發生頻率顯著增加。說明孤束核中GABAB受體表達下調與TLESR的發生及其合并反流減少存在相關性。但GABAB受體表達在TLESR發生過程中的調控機制仍不清楚，可能與孤束核中GABA神經遞質含量變化有關，仍需進一步實驗分析。同時我們發現與空白注射組相比，GABAB受體拮抗劑saclofen組的GABAB受體表達上調，這也許是由GABAB受體被拮抗引發的代償性變化。既往研究表明，通過一定手段干預孤束核可調節消化道運動[17-19]，而本實驗結果進一步提示孤束核中GABAB受體在胃擴張誘發TLESR發生及其合并反流的過程中發揮重要作用，但具體的機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] 中華醫學會消化病學分會胃腸動力學組.胃食管反流病治療共識意見（2007，西安）[J].中華消化雜志，2007， 27（10）：689-690.

[2] Dent J，Holloway RH，Toouli J，et al. Mechanisms of low esophageal sphincter incompetencein patients with symptomatic gastroesophageal reflux[J].Gut，1988，29（12）：1020-1028.

[3] 林三仁，許國銘，胡品津，等.中國胃食管反流病共識意見[J].胃腸病學，2007，12（4）：233-239.

[4] 查慧，謝小平，侯曉華.胃食管反流病患者酸反流與食管運動功能障礙的關系[J].胃腸病學，2006，11（1）：41-44.

[5] 于霞，阿依古力·阿不力米提，蔣麗麗. 高分辨率食管測壓及24 h食管阻抗-pH值對功能性燒心和非糜爛性反流病患者的監測結果分析[J]. 中國醫學裝備，2017， 14（9）：92-95.

[6] Kuo P，Bravi I，Marreddy U，et al. Postprandial cardiac vagal tone and transient lower esophageal sphincter relaxation（TLESR）[J]. Neurogastroenterology & Motility the Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society，2013，25（10）：841-e639.

[7] Fawley JA，Peters JH，Andresen MC. GABA（B）-mediated inhibition of multiple modes of glutamate release in the nucleus of the solitary tract[J]. Journal of Neurophysiology，2011，106（4）：1833.

[8] Boeckxstaens GE，Beaumont H，Mertens V. Effects of lesogaberan，a novel GABA（B）-receptor agonist，on reflux and lower esophageal sphincter function in patients with gastroesophageal reflux disease[J]. Gastroenterology，2010，139：377-379.

[9] Chi Wang，De-Feng Zhou，xiao-Wei Shuai，et al. Effects and mechanisms of electroacupuncture at PC6 on frequency of transient lower esophageal sphincter relaxation in cats[J]. World Journal of Gastroenterology（English Edition），2007，13（36）：4873-4880.

[10] 彭艷，易受鄉，李振海，等.毫針不同刺激強度對胃擴張疼痛大鼠脊髓背角NMDA受體和P物質的影響[J].世界華人消化雜志，2009，17（13）：1339-1345.

[11] Mittal RK，Holloway RH，Penagini R，et al. Transient lower esophageal sphincter relaxation[J]. Gastroenterology，1995，109：601-610.

[12] 王馳，陳欣，謝鵬雁，等.他克林對食管運動的影響及電針刺治療[C].//2014中華醫學會北京分會消化系病學術年會論文集，2014：77.

[13] Pin JP，Kniazeff J，Binet V，et al. Activation mechanism of the heterodimeric GABA（B） receptor[J]. Biochemical Pharmacology，2004，68（8）：1565-1572.

[14] Fawley JA，Peters JH，Andresen MC. GABA（B）-Mediated inhibition of multiple modes of glutamate release in the nucleus of the solitary tract[J]. Journal of Neurophysiology，2011，106（4）：1833.

[15] Boeckxstaens GE，Beaumont H，Mertens V. Effects of? lesogaberan，a novel GABA（B）-receptor agonist，on reflux and lower esophageal sphincter function in patients with gastroesophageal reflux disease[J]. Gastroenterology，2010，139：377-379.

[16] Boeckxstaens GE，Denison H，Jensen JM，et al. Translational gastrointestinal pharmacology in the 21st century：The lesogaberan story'[J]. Current Opinion in Pharmacology，2011，11（6）：630.

[17] Cossentino MJ，Mann K，Armbruster SP，et al. Randomised clinical trial：The effect of baclofen in patients with gastro-oesophageal reflux-a randomised prospective study[J]. Alimentary Pharmacology & Therapeutics，2012， 35（9）：1036-1044.

[18] Tsoukali E，Sifrim D. The role of weakly acidic reflux in proton pump inhibitor failure，has dust settled[J]. Journal of Neurogastroenterology & Motility，2010，16（3）：258-264.

[19] 陳姝，雍春燕，陳恒，等.胃擴張模型大鼠迷走神經脊核胃相關神經元對不同針刺穴位的反應[J].中國組織工程研究，2014，（36）：5842-5846.

（收稿日期：2018-09-11）