桂枝茯苓丸對臍血來源樹突狀細胞分化、成熟 及免疫活性的影響

貴陽中醫學院解剖學教研室，貴州 貴陽 550025

桂枝茯苓丸(Gui Zhi Fu Ling Pills，GZFLP)具活血化瘀、消癥散結之功，常用于治療瘀阻胞宮證。藥理研究表明，桂枝茯苓丸具有一定的抑瘤作用，其作用機理與調節機體免疫功能的作用密切相關[1]。機體內存在多種免疫監視機制，發揮著重要的抗腫瘤作用。而免疫活性細胞的致敏、激活和擴增又依賴于抗原呈遞細胞(antigen presenting cell，APC)呈遞相應的抗原多肽和共刺激信號。樹突狀細胞(dendrititc cell，DC)是機體內最強的APC，它能激活T細胞，在誘導免疫應答中起著重要作用[2]。DC在人外周血中含量較少，因此，尋找體外合適的DC前體細胞并誘導分化其成熟以獲得足夠多的DC是DC抗腫瘤治療的關鍵因素。本實驗以人臍血作為DC前體細胞來源，采用桂枝茯苓丸體外誘導培養，旨在進一步研究桂枝茯苓丸抗腫瘤的機制，為中醫藥防治腫瘤提供一定依據。

1 儀器材料

1.1 臍血 在無菌下，采集健康足月妊娠產婦臍血100 mL/份，肝素抗凝。

1.2 藥物 桂枝茯苓丸(桂枝10 g、茯苓10 g、牡丹皮10 g、赤芍10 g、桃仁10 g)購自貴陽中醫學院第一附屬醫院中藥藥房，加適量水，浸泡2 h，先武火后文火煎煮2次，經過濾除渣后，水浴濃縮成1 g/mL中藥水煎液，調pH值至7.0，經0.22 μm微孔過濾器過濾除菌，放4 ℃冰箱保存[3]。

1.3 試劑 RPMI1640培養液(美國GIBCO公司)；重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF，美國Pepro Tech公司))；IL-4試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；鼠抗人CD80、CD40、CD83和CD86(北京中杉金橋生物技術有限公司)；抗β-Actin單克隆抗體(北京康為生物技術有限公司)。

1.4 儀器 CJ-1D超凈工作臺(天津泰斯特公司)；CO2恒溫培養箱(美國Napco公司)；電控恒溫水浴箱(北京長安科學儀器廠)；LD4-2A型離心機(上海醫用分析儀器廠)； 電子天平(德國OHAUS公司)；倒置相差顯微鏡(日本尼康公司)；病理圖像分析系統(Motic Med CMIAS)；Mini Trans-Blot型蛋白轉印系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 臍血單核細胞的獲取 在無菌條件下，取新鮮臍血(肝素抗凝)9 mL，加入1倍體積的無血清RPMI1640培養液稀釋，吹打混勻后2∶1疊加于淋巴細胞分離液層(淋巴細胞分離液與稀釋濃縮臍血比為1∶2)，經密度梯度離心(20 ℃，2000 r/min，20 min)，離心后分為血清層、單個核細胞層(白膜層)、淋巴細胞分離液層和紅細胞層，小心吸取白細胞層，即為臍血單個核細胞，用RPMI1640培養液離心洗3次，每次1500 r/min，10 min，去除上清，用含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養液重懸細胞沉淀，加入至75 cm2培養瓶中培養3 h，收集貼壁的單核細胞進行體外培養。

2.2 體外培養及倒置相差顯微鏡觀察(采用6孔板，每孔2 mL) 將獲取的單核細胞分為4組即空白對照組、細胞因子組(GM-CSF+IL-4)、桂枝茯苓丸組(GZFLP)、桂枝茯苓丸+細胞因子組(GZFLP+GM-CSF+IL-4)進行體外培養。各組取1 mL細胞懸液和1 mL10%胎牛血清，其中細胞因子組加入100 ng/mL GM-CSF20 μL及50 ng/mL的IL-4 20 μL，桂枝茯苓丸組加入1 mL100 μg/mL桂枝茯苓丸中藥液，桂枝茯苓丸+細胞因子組分別加入1 mL100 μg/mL桂枝茯苓丸中藥液及100 ng/mLGM-CSF20μL+50 ng/mL的IL-420 μL。各組均置37 ℃、5%CO2培養箱內培養10 d，每日在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態及生長狀態，重點觀察未成熟樹突狀細胞和成熟樹突狀細胞的形態結構特征。

1.2.3 瑞氏-吉姆薩染色法 取無菌24孔培養板,每孔加入多聚賴氨酸溶液包被、烘干、每孔用PBS清洗3次、吹干，收集各組樹突狀細胞、經PBS清洗用含10%胎牛血清RPMI1640培養液重懸細胞、入37 ℃、5%CO2培養箱培養1 h使細胞貼壁，細胞貼壁后去除完全培養基，再用PBS清洗3次，之后每孔加入4%多聚甲醛固定液固定20 min，去除多聚甲醛殘余液，使用瑞氏-吉姆薩染色液試劑盒進行細胞染色、鏡下觀察。

2.4 Western Blot法檢測 依據細胞膜蛋白抽提試劑盒說明提取膜蛋白，依據BCA蛋白定量試劑盒說明測定蛋白濃度，根據SDS-PAGE凝膠制備試劑盒灌膠和電泳，然后進行轉膜，按WB(HRP)試劑盒加入目的蛋白CD80、CD40、CD83、CD86染色，將化學發光檢測底物工作液滴在印跡膜上，在暗室中將X光片置于膜上曝光，定影至膠片透明，風干備用。

2.5 T細胞獲取和鑒定 取同種異體臍血，按上述方法獲得單核細胞，取非貼壁細胞即為淋巴細胞，將3×107/mL的淋巴細胞注入尼龍毛柱，放入37 ℃，5%CO2恒溫培養箱靜置1 h。用預溫的37 ℃含20%小牛血清RPMI1640培養液洗柱，洗下的即為T細胞。取T細胞進行涂片，丙酮固定10 min，免疫細胞化學染色顯示細胞呈CD3+亞型、CD20-型。將剩余T細胞放入上述培養液中，并加入細胞因子人白細胞介素2(rhIL-2)500 μL，于37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養待用。

2.6 MTT法檢測T細胞的增殖 將實驗各組DC用絲裂霉素C(25 μg/mL)處理后作為刺激細胞，取獲得的T細胞作為反應細胞。按1∶10、1∶50、1∶100的比例分別加刺激細胞及反應細胞于96孔培養板中。每組3個復孔，其中T細胞為2×105/孔于37 ℃，5%CO2培養4 d，每孔加入MTT20 μL繼續培養3 h，離心，棄上清，每孔加入DMSO150 μL，振蕩10 Min，用酶標儀檢測D570值，結果用3個復孔平均值計算。

3 結果

3.1 單核細胞形態 單核細胞呈圓形、貼壁生長、表面光滑、細胞核呈圓形、位于細胞中央。

3.2 倒置顯微鏡觀察各組DC結果 培養第1天，可見細胞小、均勻散在分布；第2天時，細胞大部分貼壁，有少量懸??；第3天時細胞懸浮成簇，第7天時，各組懸浮細胞增多，體積增大；第12天時，細胞表面出現突起。鏡下觀察發現，桂枝茯苓丸+細胞因子組DC數量最多，細胞因子組DC數量比桂枝茯苓丸+細胞因子組少、但比桂枝茯苓丸組多，空白對照組DC數量最少。如圖1所示。

3.3 瑞氏-吉姆薩染色結果 培養5 d后觀察發現，各組細胞大小不一，胞質呈藍紫色、細胞核多為圓形、未成熟DC細胞內有大量囊泡，細胞表面突起短而少；而成熟DC細胞內囊泡少，表面突起多而長。桂枝茯苓丸+細胞因子組DC數量最多，桂枝茯苓丸組DC數量比桂枝茯苓丸+細胞因子組少、與細胞因子組比較差異無統計學意義(P<0.05)，空白對照組DC數量最少。如圖2所示。

3.4 Western Blot法檢測 未成熟DC的CD80、CD40、CD83、CD86蛋白表達見表1，成熟DC的CD80、CD40、CD83、CD86蛋白表達。見表2。

分組空白對照組因子組桂枝茯苓丸組桂枝茯苓丸+因子組 CD80/β-Actin0.069±0.0150.135±0.0180.115±0.0160.187±0.013?CD40/β-Actin0.056±0.0180.129±0.090.116±0.080.156±0.04?CD83/β-Actin0.0046±0.00310.0214±0.00210.0192±0.00150.0207±0.0014?CD86/β-Actin0.056±0.0040.140±0.0070.153±0.0080.188±0.005?

注：桂枝茯苓丸+因子組與其它組比較，*P<0.05。

分組空白對照組因子組桂枝茯苓丸組 桂枝茯苓丸+因子組CD80/β-Actin0.071±0.009 0.1921±0.00860.1878±0.01170.2141±0.0084?CD40/β-Actin0.061±0.034 0.927±0.040.884±0.0441.033±0.043?CD83/β-Actin0.021±0.013 0.494±0.035 0.456±0.0420.725±0.034?CD86/β-Actin0.062±0.034 0.917±0.049 0.912±0.0421.032±0.043?

注：桂枝茯苓丸+因子組與其它組比較，*P<0.05。

3.5 對T細胞增殖的影響 見表3。

分組空白對照組因子組桂枝茯苓丸組桂枝茯苓丸+因子組1∶100.123±0.0120.654±0.0620.717±0.071 0.890±0.072?1∶500.095±0.0210.475±0.0370.493±0.042 0.569±0.039?1∶1000.074±0.0230.376±0.0250.327±0.039 0.353±0.041?

注：桂枝茯苓丸+因子組與其它組比較，*P<0.05。

4 討論

現代免疫學認為,機體的免疫力與疾病的發生密切相關?！秲冉洝贰罢龤獯鎯龋安豢筛桑爸鶞?，其氣必虛”。祖國醫學的正氣即人體的免疫力，它的物質基礎是天然免疫與獲得性免疫的免疫活性物質[4]。T細胞參與機體的細胞免疫，它具有識別異己、保護機體的免疫調節作用。隨著腫瘤病人的增多，研究腫瘤疫苗已經成為當務之急。T細胞是機體免疫反應的介導者，它的功能活動受到DC的監控。在抗腫瘤中，DC是目前已知的體內功能最強的抗原呈遞細胞，抗原的識別、攝取、加工、提呈及T細胞的致敏、激活和擴增均依賴于抗原呈遞細胞的參與和調節，因此，DC可以啟動機體免疫反應。研究證實，DC激發T細胞增殖及抗原提呈能力是巨噬細胞和B細胞的100～1000倍，在抗原特異性細胞毒性T細胞為主的腫瘤過繼免疫治療中起著十分重要的作用。在合適的細胞因子組合下，能夠在體外利用臍血成功誘導出成熟DC[5]。

目前，已發現多種可誘導DC成熟的刺激因子，如TNF-α、LPS、CD40L等[6]，但有一定的細胞毒性或功能尚未明確而限制了它們的應用。中醫藥在防治腫瘤方面有較大的優勢。尤其是中藥復方可針對腫瘤發病多因素的特點，因此，尋找中藥復方替代細胞因子誘導DC成熟迫在眉睫。

桂枝茯苓丸出自張仲景《金匱要略》，該方由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍藥5味中藥組成，具有活血化瘀、消癥散結之功效，常用于治療婦科瘀阻胞宮證。中醫學認為血瘀是導致腫瘤的主要病因之一，大量臨床實踐證明，桂枝茯苓丸廣泛用于各種血瘀癥的治療[7]，在治療婦科腫瘤方面取得了可靠的療效。現代藥理學表明，桂枝茯苓丸具有一定的抑瘤作用，該方的抑瘤作用機理與其對機體免疫功能的調節作用密切相關。據報道，桂枝茯苓丸能促進免疫功能低下荷瘤機體分泌細胞因子，有效殺傷腫瘤細胞[8]。另有研究表明，桂枝茯苓丸的抗腫瘤作用機制和誘導腫瘤細胞凋亡有關，通過影響腫瘤細胞Survivin、p21waf/cip等基因發揮抑瘤作用[9]。本研究將桂枝茯苓丸制備成1 g/mL中藥水煎液，調pH值至7.0，經0.22 μm微孔過濾器過濾除菌，能夠在除菌的同時充分保留其藥理活性。然而，目前對桂枝茯苓丸抑瘤機理的研究還待進一步深入，其是否能通過誘導單核細胞分化成熟為DC，激活T細胞增殖，增強機體抗腫瘤作用，還未曾報道。

研究經臍血單核細胞為前體細胞，以具有免疫、抗腫瘤作用的桂枝茯苓丸為誘導劑，探討桂枝茯苓丸體外對人臍血單核細胞來源樹突狀細胞的分化、成熟及免疫活性的影響，并探討其作用機制。結果顯示，各組單核細胞體外培養均可誘導為樹突狀細胞，表現為細胞體積增大，形態不規則，細胞表面有較多的樹突狀突起，有很強的促T細胞增殖能力。各組細胞表面標志物蛋白(CD80、CD40、CD83、CD86)隨樹突狀細胞成熟表達增強，尤以桂枝茯苓丸+細胞因子組誘導的樹突狀細胞多、表達強(P<0.05)、形態學特征更為明顯；誘導T細胞的增殖能力強(P<0.05)。研究結果提示，桂枝茯苓丸可促進人臍血單核細胞來源的樹突狀細胞分化、成熟、增強樹突狀細胞的免疫活性，并與細胞因子協同作用效果更佳。然而，桂枝茯苓丸誘導臍血單核細胞分化為樹突狀細胞的物質基礎還需進一步研究，不同濃度的桂枝茯苓丸誘導人臍血單核細胞分化為樹突狀細胞的效果的研究還需進一步深入。此外，采用流式細胞技術對樹突狀細胞表面蛋白的檢測、細胞周期的觀察是本課題下一步研究的重點。