彝族“黃藥”艾納香中黃酮的提取工藝優選研究

中央民族大學藥學院，北京 100081

彝族“黃藥”的中藥名為艾納香，又稱為大風艾、牛耳艾、大骨風、冰片艾等，為菊科艾納香屬植物艾納香(BLumeabaLsamiferaDC.)全草[1]，主要分布在云南、貴州、廣西、廣東等地[2]。艾納香最早記載于公元741年陳藏器所編著的《本草拾遺》：“主癬避蛇”，由于療效確切，在歷代本草等相關文獻中均有關于艾納香用途、用法及療效等方面的記載[3]。艾納香以其全草或地上部分入藥，其性味苦、溫、辛，主要有祛風除濕、活血調經、消腫止痛等功效[4]。彝醫認為其性味苦，入脾、肺氣路，有清熱解毒、逐瘀化痰的功效，在中國西南彝族地區被廣泛應用于抗腫瘤，尤以抗肺癌效果為佳[5]。

文獻報道，艾納香的主要成分為黃酮和揮發油，同時也含有少量的苷類成分，其中黃酮類成分的研究最為廣泛。目前報道的黃酮類物質主要為黃酮(醇)類、二氫黃酮類和查爾酮類三大類[6-10]。其藥理作用也主要集中在黃酮類物質的作用上，具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、抗炎以及保肝等活性[11-13]。為合理利用彝族“黃藥”艾納香植物中的黃酮類化合物，需要優化對其進行最大化提取分離的方法。目前已有學者對“黃藥”艾納香的總黃酮提取工藝和含量測定進行了考察，黃永林等[14]采用紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，對艾納香葉、小枝條、莖中總黃酮含量進行了測定，結果顯示葉中總黃酮含量最高為2.94%，小枝條含量最低只有1.21%。羅夫來等[15]用紫外分光光度法測定總黃酮含量，以提取率為指標，用正交實驗方法優選艾納香最佳提取工藝。和銀霞等[16]用超聲波提取方法考察了艾納香的提取工藝，并測定不同部位總黃酮的含量。課題組前期研究結果[17]表明，艾納香的黃酮成分主要富集在二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位。本研究在羅夫來等[15]研究基礎上考察了提取次數對總黃酮提取率的影響，并利用正交設計實驗選取乙酸乙酯萃取部位對彝族“黃藥”艾納香中總黃酮進行考察，以期找到最佳的提取工藝，為更好地開發利用艾納香并發揮其藥用價值提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AdventurerOHAUS電子天平，UV1700PC紫外可見分光光度計(上海鳳凰光學儀器有限公司)。

1.2 藥材 “黃藥”為菊科艾納香屬植物艾納香的干燥莖、葉，購自河北安國藥材市場，經DNA條形碼鑒定為真品。

1.3 試劑 蘆丁對照品(北京百靈威科技有限公司)。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇等均為分析純。

2 方法

2.1 艾納香中總黃酮測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品15.1 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，即得到0.151 mg/mL對照品溶液。

2.1.2 標準曲線繪制精密 吸取蘆丁對照品溶液0、1、2、4、6、8 mL，分別置于25 mL的容量瓶中，依次加入5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min；10% AL(NO3)3溶液1 mL，搖勻，放置6 min；4% NaOH溶液10 mL，搖勻，靜置15 min，加水至相應刻度。在510 nm處測定各溶液的吸光度。以質量濃度對吸光度進行線性回歸，得回歸方程A=11.278C+0.0275，R2=0.9992。表明蘆丁在0.00604～0.04832 mg/mL與吸光度線性關系良好。標準曲線如圖1。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取艾納香藥材2.0 g，根據正交試驗設計用不同體積分數的乙醇按不同的料液比、不同的加熱時間以及不同加熱次數進行回流提取，濾過，收集濾液，減壓濃縮成浸膏。將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉。精密稱取萃取物干粉25.0 mg置于25 mL容量瓶中，充分溶解后，做供試品溶液(濃度為1 mg/mL)待用。

2.1.4 精密度試驗 稱取艾納香藥材2.0 g，用80%的乙醇按料液比為15∶1加熱回流3次，每次3 h，收集濾液，減壓濃縮成浸膏。將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉。精密稱取萃取物干粉25.0 mg置于25 mL容量瓶中，充分溶解后，做供試品溶液待用。精密量取2 mL供試品置于25 mL容量瓶中，按“2.1.2”項下處理，測定吸光度，連續測定5次，計算吸光度RSD值為0.515%，表明儀器的精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 稱取同一批艾納香藥材5份，按“2.1.4”項下制備供試品溶液，精密量取2 mL供試品置于25 mL容量瓶中，其余的步驟按“2.1.2”項下方法進行顯色處理，測定吸光度值，結果吸光度值得RSD值為1.035%。

2.1.6 穩定性試驗 精密量取2 mL供試品置于25 mL容量瓶中，其余步驟按“2.1.2”項下方法加顯色劑顯色進行處理，分別在0、5、10、15、20、25、30 min測定其吸光度值，計算RSD值為0.5627%，樣品在30 min內穩定性較好。

2.1.7 加樣回收率試驗 稱取同一批艾納香藥材1.0 g，按“2.1.4”項下制備供試品溶液，精密量取5份2 mL供試品溶液置于25 mL容量瓶中，分別加入0.151 mg/mL的蘆丁對照品2 mL，其余的步驟按“2.1.2”項下方法進行顯色處理，測定吸光度值，結果平均回收率為97.3%，RSD值為0.753%。

2.1.8 總黃酮的測定 取艾納香藥材按“2.1.3”制備供試品溶液，按“2.1.2”項下方法進行顯色處理，測定吸光度值，代入回歸方程，計算總黃酮的含量。

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響 對乙醇濃度設5個濃度梯度即40%、50%、60%、70%、80%。精密稱取艾納香全草2.0 g，置于100 mL三角瓶中，加相應濃度乙醇 40 mL，70 ℃水浴回流提取3次，每次 2 h，提取液過濾，合并濃縮得浸膏，將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉，精密稱取萃取物干粉25 mg置于25 mL容量瓶中，按“標準曲線的制備”項下方法顯色后，測吸光度，根據“2.1.2標準曲線”回歸方程計算總黃酮含量和提取率。

由圖2可知，當乙醇濃度小于 50% 時，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮提取率程增加趨勢; 當乙醇濃度為 50% 時，總黃酮提取率最高; 此后，再增加乙醇濃度，總黃酮提取率反而下降，因此，確定乙醇濃度為 50% 左右較為合適。

2.2.2 提取時間對總黃酮提取率的影響 考察提取時間的影響，設置5個時間梯度，即0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h。精密稱取2.0 g艾納香全草，置于100 mL 三角瓶中，加50 %乙醇 40 mL，70 ℃ 水浴回流至規定時間，提取液過濾，共提取3次，合并濃縮得浸膏，將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉，精密稱取萃取物干粉25 mg置于25 mL容量瓶中，按“標準曲線的制備”項下方法顯色后，測吸光度，根據“2.1.2標準曲線”回歸方程計算總黃酮含量和提取率。

由圖3可知，當提取時間小于1.5 h時，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率程增加趨勢；當提取時間為1.5 h左右時，總黃酮提取率最高；此后，再延長提取時間，總黃酮提取率反而略微下降。因此，確定提取時間為1.5 h左右較為合適。

2.3 因素水平的選擇 根據預實驗以及相關文獻研究選取影響艾納香回流提取的乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取次數(C)和提取時間(D)為考察因素，選用L9(34)正交試驗表篩選最佳工藝。見表1。

表1 因素與水平

2.4 正交試驗 取艾納香藥材2 g，按照設計的實驗方案進行提取，濾過，減壓濃縮得浸膏，浸膏水溶液依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，濃縮凍干成干粉。稱取相應質量的萃取物粉末，配置成供試品溶液，測定其吸光度值，根據蘆丁標準曲線方程計算艾納香總黃酮百分含量。以該結果列入正交設計表中進行統計。

總黃酮提取率(%)=總黃酮的含量/藥材的重量

表2 正交實驗設計和結果

由表2、3可知，各因素對提取率的影響依次為B>C>D>A，即料液比>提取次數>提取時間>乙醇濃度。由此得到最佳提取工藝為A1B3C2D2，即乙醇的濃度為50%，加入16倍量的乙醇，提取時間為1.5 h，提取次數3次。

表 3 方差分析結果

F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

2.5 驗證試驗 稱取3份艾納香藥材各2 g，按照上述優選的最佳工藝進行提取，萃取得到萃取物干粉，照上述建立的測定方法條件測定，計算艾納香藥材中總黃酮提取率。結果艾納香藥材中總黃酮的提取率分別為2.74%、2.81%、2.77%，平均值為2.77%，RSD值為1.27%。結果表明所選工藝合理、穩定、可行。

3 討論

測定黃酮含量目前最常用的方法是紫外-可見光分光光度法(比色法)，是被測物質在適當的顯色劑顯色后，在特定波長處或一定波長范圍內的測定吸光度或發光強度，從而對該物質進行定性和定量分析的方法[18]。總黃酮含量的測定往往采用蘆丁作對照品，經亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色后，在510 nm處測定吸光度值[14]。

實驗選擇對總黃酮提取率影響量較大的乙醇濃度、料液比、提取時間以及提取次數為4個主要因數，采用正交實驗法優化艾納香的總黃酮提取工藝。實驗結果可知，提取次數對艾納香中總黃酮的提取影響最大，其次為乙醇濃度、提取時間和料液比。最終優選的工藝條件為采用16倍量的50%的乙醇提取3次，每次提取1.5 h。該工藝驗證，3次提取結果的總黃酮提取率RSD值為2.0%，說明該工藝重復性良好，且總黃酮提取量最大，因此確定為最佳提取條件，為后續的艾納香研究實驗作為參考。隨著臨床研究的進一步發展，艾納香中總黃酮的藥理作用及作用機制將進一步被闡釋說明，本實驗得出的最佳提取工藝將對彝族“黃藥”艾納香的深度開發利用提供了可靠的實驗依據。