星點設計-效應面法優選“扶正固本”方 最佳提取工藝

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1.西藏大學醫學院藥學系，西藏 拉薩 850000；2.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600

惡性腫瘤是威脅人類健康的重大疾病，也是導致人類死亡的主要原因之一[1]。目前，惡性腫瘤的治療主要包括手術治療、放射治療和化學治療，其中化療作為一種全身治療方式能夠在局部或全身減輕腫瘤細胞負荷[2]。臨床中腫瘤發生、發展等同機體免疫功能密切相關，腫瘤化療過程中由于化療藥物體內選擇性差，在殺傷腫瘤細胞時會損傷免疫細胞，嚴重影響自身免疫系統抗腫瘤機制出現免疫抑制，對免疫功能進行調節就可抑制腫瘤細胞的生長和擴散[3]。與傳統化療藥物相比，中藥在抗癌方面具有安全高效、毒副作用小的優點，因此被廣泛用于防治惡性腫瘤[4]。“扶正固本”是中醫治病的主要治則之一，可以減輕化療藥物所導致的機體免疫功能損傷。經現代醫學的研究證實：“扶正固本”法是對機體的免疫功能進行調節，利于淋巴細胞的增殖和促進網狀內皮系統的活力進而增強機體的抵抗力[5]。惡性腫瘤在中醫學中稱為“積證”、“癭病”等。《醫宗必讀》中記載：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”，表明正氣虧虛是惡性腫瘤發生、發展的根本原因。傳統中醫理論認為扶助正氣，穩固本源能夠達到“正氣存內、邪不可侵”的目的[6]。為了充分發揮中醫藥在腫瘤治療過程中的優勢，研究中選取了由人參、黃芪、茯苓等七味中藥組成的“扶正固本”方。并對其提取工藝進行優選，為其進一步研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-3010型紫外可見分光光度計(日本東芝公司)，Sartorius CP225D型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，B-220恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)，DZF型真空干燥箱(北京市永光明醫療儀器有限公司)，RE53CS型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)，KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 D(+)無水葡萄糖(D0806AS，美侖生物)，藥材購自安國藥材市場經鑒定符合《中國藥典》2015年版一部的規定，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

“扶正固本”方由人參、黃芪、茯苓、白術、五味子、澤瀉、炙甘草七味藥組成。經查閱文獻發現多糖為扶正固本方的主要活性成分，因此采用水煎煮法提取，實驗采用星點試驗-效應面法，以總多糖含量和出膏率的綜合評分為評價指標，考察提取時間、提取次數及加水量對實驗結果的影響。

2.1 多糖的含量測定[7]

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對照品50.00 mg，置50 mL的容量瓶中，加水定容，制成1.00 mg/mL的葡萄糖對照品儲備溶液。

2.1.2 5%苯酚溶液的制備 精密量取80 ℃熔化的苯酚溶液5 mL，至100 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水至100 mL，搖勻。4℃冷藏，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取處方量藥材，按照設計方案加水提取，絹布過濾，定容到600 mL。取定容液5 mL，3500 r離心5 min，取上清1 mL，加95%乙醇5 mL，混勻靜置4 h，3500 r離心15 min，沉淀加10 mL水溶解，取1 mL加水定容至5 mL即得供試品溶液。精密量取供試品溶液2 mL，加5%苯酚溶液1 mL 搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸振搖5 min，90 ℃加熱15 min，室溫冷卻30 min，490 nm波長處測定吸光度。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取葡萄糖標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2、2.5 mL分別置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。制備濃度分別為0.0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。精密量取上述各溶液2 mL，加5%苯酚溶液1 mL搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸振搖5 min，90 ℃加熱15 min，室溫冷卻30 min，490 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。經計算得線性回歸方程為，y=20.563x+0.2071(r=0.9992，n=6)無水葡萄糖在0.0～0.05 mg/mL范圍內具有良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗 取質量濃度為0.02 mg/mL的葡萄糖對照品溶液按照“2.1.4”項實驗方法，連續測定5次。結果顯示葡萄糖溶液吸光度值的RSD=0.075%(n=5)。表明儀器的精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取同一供試品溶液，平行操作6份，按照“2.1.4”項實驗方法測定吸光度值，結果顯示吸光度值的RSD=0.105%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h后，“2.1.4”項實驗方法測定吸光度值。結果吸光度值的RSD=0.097%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.8 加樣回收率 精密稱取供試品溶液5 mL，分別加入質量濃度為0.02 mg/mL的對照品溶液適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，“2.1.4”項實驗方法測定吸光度值。計算加樣回收率=97.26±0.45%。

2.2 出膏率測定 精密量取提取液75 mL置蒸發皿中，80℃水浴蒸干，干燥箱105℃干燥至恒重，室溫下置干燥器中冷卻30 min，精密稱定重量，計算干浸膏得率。

2.3 星點實驗設計

2.3.1 因素水平表選擇 提取時間(A)、提取次數(B)以及加水量(C)3個因素作為本研究的考察對象，并確定其用量范圍為：A：1～2，B：1～3，C：8～12。采用效應面法可連續的對實驗的各個水平進行分析。以出膏率(Y1)、含糖量(Y2)、綜合評分(Y3)作為測定指標進行實驗考察。實驗設計見表1。

表 1 設計實驗因素水平及編碼

2.3.2星點方案及結果 實驗方案及結果見表2。

表 2 實驗方案及結果

表3 二次回歸模型的方差分析結果

注：*P<0.05模型或考察因素有顯著影響；**P<0.01模型或考察因素有極顯著影響；NS>0.05。

2.3.3 擬合模型的建立 采用Design-Expert 8.0.6.1統計軟件對實驗結果進行分析處理，以綜合評分Y3為因變量，得二次多項式擬合方程。Y3=-1.98097+0.095825A+0.31370B+0.39804C+0.075850AB-0.00175AC-0.0082625BC-0.057200A2-0.034525B2-0.018237C2(r=0.9728，P<0.01)對上述擬合模型進行顯著性檢驗，結果見表3。實驗結果可見，實驗模型有很高的顯著性(P<0.01)。其中一次項B對Y3影響顯著(P<0.01)，二次項中C2對Y3有顯著影響(P<0.05)；一次項A、C，二次項A2、B2及交互項對Y3的影響不顯著(P>0.05)。r=0.9728，說明模型能夠很好地反映響應值的變化，可以用此模型來分析和預測扶正固本方的最佳提取工藝。

2.3.4 響應面結果分析及最佳處方的確定 利用Design-Expert V8.0.6.1軟件，當將1個因素的編碼值設定為0時，另外2個因素與響應值包封率的三維響應面圖自動生成，結果如圖2所示。在等高線圖中，圓心的位置為極值條件出現的位置，等高線圖越趨近于圓形，越說明此時的兩個因素之間的相互作用對包封率的影響越大。越接近圓心位置，其綜合評分的值越大。圖2清晰的表明了B對包封率的影響最大。等高線圖越扁平，表示因素之間的相互影響越小，A、C兩因素之間的影響最小。在規定的提取時間、次數、加水量的范圍內，實驗結果的最優最佳處方為提取時間2 h，加10倍量水，提取3次。

2.3.5 驗證實驗 根據效應面法優選出的結果制備3批供試品，并對3批樣品的多糖含量及出膏率進行測定。表4結果顯示，根據星點設計-效應面法優選出的提取方法提取，綜合評分Y3=0.8751%，將最優處方代入擬合方程得出Y3=0.9415，真實值與預測值接近，說明此方法可行。

表 4 驗證實驗

3 討論

扶正固本方由人參、黃芪、茯苓、白術、五味子、澤瀉、炙甘草七味藥組成。以人參為君，大補元氣。臣以黃芪入脾經而補中氣，固表氣，炙甘草補脾和中，三藥相配可大補一身之氣；五味子酸溫收斂，入腎而滋腎水，固下焦，收耗散之氣，配人參一補一斂，益氣養陰，補斂合法；佐以澤瀉利濕泄濁，濁得以泄，清得以存；脾胃氣虛，運化失常，故佐以白術健脾燥濕，既助參芪補脾胃之氣，又增強脾之運化，以助后天生化之源，更以其苦燥之性，燥濕以利健脾；脾主運化水濕，脾胃既虛，則濕濁易于停滯，故佐以茯苓，其味甘以健脾，淡以滲濕，使邪去而正氣得復。

星點設計-效應面法一種新型的實驗設計方法，集數學和統計學方法于一體，具有試驗次數少、試驗精度高、可連續對實驗各水平進行分析等特點[8]。研究采用星點設計-效應面法，通過二項式擬合描繪了三維響應面，所得二項式復相關系數r=0.9728，表明采用此法優化扶正固本方提取工藝確實可行。通過響應面效果圖可清晰了解影響提取效果的3個因素的效應趨勢。從效果圖可見，影響提取效果的各因素關系是：提取次數>提取時間>加水量。考慮到實驗的可行性，結合效應面法優化結果將提取工藝確定為提取時間2 h，加10倍量水，提取3次。