百草枯對大鼠血腦屏障及認知記憶功能的影響

馬 慧，李紫喬，趙 麗，孫 艷*

(哈爾濱醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

百草枯(paraquat，PQ)，又稱克無蹤，分子式為C12H14N2C12，是有機雜環類接觸性除草劑，因其對農作物損害較小，除草效果好，在世界各國廣泛使用[1]。PQ經皮膚接觸、呼吸道和消化道進入人體，造成急性中毒，至今尚無特效解毒劑[2]。我國作為發展中的農業大國，PQ消費量在2001—2011年間由1 560 t增至9 080 t，位居世界第一，雖然國家已頒布法令，于2014年7月之后不允許再生產和使用水劑，但PQ母藥的生產仍未予禁止。考慮到世界各國已生產和使用PQ帶來的環境和健康風險需要很長一段的時間來消化，加之目前仍無治療PQ中毒的有效方法和解毒劑，有研究者預測，在未來較長的一段時間，PQ仍將是全球環境與健康領域的重要風險因子[3]。PQ極易溶于水，在酸性和中性溶液中穩定存在，但在堿性溶液中容易分解。PQ通過職業、食物和飲用水等慢性低劑量暴露作用于人群，增加帕金森病(Parkinson’s disease，PD)等中樞神經系統退行性疾病的發病風險[3]。使用PQ的人群比未使用過PQ的人群發生PD的危險性顯著增加，且接觸時間越長發病的危險性越高[4]。動物實驗表明PQ能引起多巴胺(dopamine，DA)能神經元減少、α-共核蛋白(α-Syn)聚集、路易小體(Lewy body，LB)形成及動物運動行為異常等類似于PD的癥狀[5-6]。細胞實驗表明，在肺上皮細胞中PQ引起活性氧的生成增加，且線粒體膜電位明顯下降，線粒體毒性明顯大于活性氧所致的氧化損傷[7]。近來有學者認為，PQ誘導中樞神經系統退行性變的前提是增加了血腦屏障的通透性，通過血腦屏障，在大腦不同區域(額葉皮質、紋狀體、海馬、小腦)積聚，作用于特定靶細胞，導致各種功能性紊亂[8]。故本文在前人研究高劑量PQ的基礎上，采用動物實驗，以低劑量PQ作為受試物，探究低劑量亞慢性接觸PQ對大鼠血腦屏障及認知、學習、記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康SPF級SD雄性大鼠45只，體質量180～200 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司(CHLJ2018031514)。將大鼠安置在動物屏障系統[SYXK(黑)2017-008]內，給予12 h/12 h明暗交替，室內溫度在18～20℃之間。適應性飼養1周后，將大鼠隨機分成3組即對照組(生理鹽水)、PQ染毒低劑量組(1 mg/kg)和高劑量組(10 mg/kg)，每組15只。腹腔注射染毒6周，每周2次，每周觀察1次體質量變化。實驗結束后每組隨機抽取5只大鼠進行伊文思藍(Evans blue，EB)滲透實驗，各組剩余的10只大鼠進行行為學實驗。

1.2 試劑與儀器

百草枯純度98%，購自上海梯希愛化成工業發展有限公司；伊文思藍和甲酰胺購自大連美侖生物技術有限公司；Morris水迷宮實驗視頻分析系統、SDT-8跳臺視頻分析系統和STT-100穿梭實驗系統均購自成都泰盟公司。

1.3 伊文思藍滲透實驗

用伊文思藍濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μg/mL的甲酰胺溶液制作伊文思藍標準曲線。每組取5只大鼠，10%水合氯醛麻醉，經左側股靜脈緩慢注入2 mL/kg伊文思藍，體循環1 h，斷頭取腦。將腦組織置于甲酰胺(10 mL/g)中，勻漿后60℃水浴24 h，12 000 r離心30 min，取上清，用紫外分光光度計檢測吸光度D(632)值，計算腦中伊文思藍含量，標準曲線為y=A x+B，則

1.4 Morris水迷宮實驗

在黑色圓形水池(直徑100 cm)中蓄水至水面高度約為45 cm，水溫維持在20～22℃之間。水池分為4個象限，在水下約2～2.5 cm處放置一個圓形透明平臺。取每組10只大鼠，實驗分為兩個階段，即訓練階段和測試階段，訓練階段：每日同一時間將大鼠面朝水池壁從4個象限依次入水，限時90 s，若90 s內大鼠找到平臺，則記錄其逃避潛伏時間及運動軌跡，若90 s內未找到平臺，則引導其找到平臺，并停留10 s，加深記憶，連續訓練4 d。測試階段：撤掉平臺后，限時90 s，記錄大鼠穿越原平臺位置的次數。

1.5 跳臺實驗

箱體底部欄桿可通電，角落處放置絕緣性平臺，每組10只大鼠實驗前放入箱體中，適應環境3 min，實驗開始后，底部欄桿通電，電壓在0～30 V之間波動，記錄5 min內大鼠第1次跳上平臺后滯留的時間(即記憶潛伏期)和跳下平臺的次數(即錯誤次數)。

1.6 穿梭箱實驗

箱體底部為可通電欄桿，中間以一個含可穿梭洞的黑色塑料板分隔成等大的兩室，每組10只大鼠，實驗開始前，將大鼠放入一室中適應5 min，實驗開始后，給予大鼠光照10 s，若大鼠穿越至另一室，記為條件反應1次，若大鼠10 s內未穿越，給予10 s電刺激(電壓36 V)，大鼠逃避電擊穿越至無電擊室，記為非條件反應1次，10 s電刺激后仍未穿越，記為錯誤反應1次。每只大鼠每天完成1次，間隔20 s，重復循環20次，連續6 d，記錄第6天每只鼠條件反應次數和錯誤反應次數。

1.7 統計學方法

應用SPSS 20.0軟件進行統計分析，Morris水迷宮中，對重復測量的逃避潛伏期采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，其余數據采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonferroni法，所有數據表示為xˉ±s，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 伊文思藍實驗結果

腦組織大體圖片顯示，與對照組相比，1和10 mg/kg PQ組藍染明顯較深(圖1)。檢測結果顯示，2個PQ劑量組大鼠腦組織的伊文思藍含量較對照組顯著升高，差異均具有統計學意義(P均＜0.05)，見圖2。

圖1 各組大鼠腦組織伊文思藍大體圖

圖2 各組大鼠腦組織中伊文思藍含量

2.2 Morris水迷宮實驗結果

1和10 mg/kg PQ染毒劑量組大鼠的運動軌跡比對照組復雜(圖3A)，對大鼠訓練期間逃避潛伏期進行重復測量的方差分析得出，不同劑量PQ引起大鼠逃避潛伏期的差別有統計學意義(P＜0.05)，不同訓練天數大鼠逃避潛伏期的差別有統計學意義(P＜0.05)，各組逃避潛伏期均下降。PQ劑量組與訓練天數之間存在交互關系(P＜0.05)，見表1。逃避潛伏期在不同劑量PQ誘導下，各訓練天數的變化趨勢不同，隨著訓練天數的增加，各組逃避潛伏期逐漸減少，且10 mg/kg PQ組下降的幅度明顯低于對照組(圖3B)，差異具有統計學意義(P＜0.05)。測試階段，1和10 mg/kg PQ組穿越原平臺位置次數均低于對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖3C。

表1 水迷宮訓練階段各組逃避潛伏期方差分析表

圖3 Morris水迷宮實驗結果

2.3 跳臺實驗結果

與對照組相比，1和10 mg/kg PQ組大鼠記憶潛伏期均降低(圖4A)，錯誤次數均增加(圖4B)，10 mg/kg PQ組錯誤次數高于1 mg/kg PQ組錯誤次數，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

圖4 跳臺實驗結果

2.4 穿梭箱實驗結果

第6天訓練結果，1和10 mg/kg PQ組大鼠條件反應次數明顯低于對照組(圖5A)，錯誤次數明顯高于對照組(圖5B)，差異均具有統計學意義(P均＜0.05)。

3 討論

圖5穿梭箱實驗結果

PQ在肺、肝、腎、心臟中的急、慢性損傷作用已有大量研究[9]，研究者逐漸開始關注PQ對腦的影響。有研究[10]表示10 mg/kg的PQ可增加血腦屏障通透性，誘導帕金森病，而在PQ中毒幸存者的血液中檢測到PQ的最高濃度為4.8μg/mL，以成年男性體質量76 kg，血容量5 000 mL為例，約0.3 mg/kg就能導致人體中毒。這個劑量相當于1/13 LD50(PQ對人群的LD50為4 mg/kg)。PQ對小鼠的LD50為130 mg/kg，10 mg/kg是可以直接引起人類中毒的[11]。但是，在PQ大量使用地區的居民和農藥噴灑者是低劑量長期接觸，所以本實驗針對低劑量PQ(1 mg/kg)進行研究，選用生理鹽水及經典高劑量PQ(10 mg/kg)進行對比。有研究表明，短暫一次性接觸PQ的新生兒，血腦屏障受損，進入腦中的PQ明顯增加[12]。血腦屏障由腦血管內皮細胞、血管基底膜和神經膠質細胞組成，是血漿與腦細胞之間的屏障，具有穩定中樞神經系統的作用。血腦屏障利用血管內皮細胞限制血管內極性物質的被動擴散。PQ通過膽堿攝取系統進入腦微血管內皮細胞。PQ能夠通過血腦屏障影響DA的合成、儲存、轉運和降解等環節破壞DA遞質的穩態，引發神經元凋亡，從而導致類PD癥[13]。在人群研究中，百草枯暴露與PD之間具有明確相關性[14]。

本文針對低劑量PQ對血腦屏障的影響進行實驗，發現1 mg/kg PQ能夠損傷血腦屏障，增加血腦屏障滲透性，進入腦中的PQ增加，從而損傷認知、學習、記憶功能。使得大鼠認知、學習、記憶功能下降。低劑量組(1 mg/kg)與高劑量組(10 mg/kg)間差異無統計學意義，由此可見低劑量PQ的影響不容小覷，低劑量接觸也能夠增加血腦屏障通透性，使PQ進入腦中作用于不同區域的腦組織，進而降低認知、學習和記憶能力。此結論為進一步研究PQ損傷血腦屏障的機制奠定了基礎，為PQ影響人類健康的預防工作提供了科學依據。