HBV研究模型新進展

畢延偉，楊小強，#，孫平楠，周小玲，*

(1.汕頭大學醫學院干細胞P2實驗室，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫學院生殖醫學中心，廣東 汕頭 515041；3. 廣東省感染病與分子免疫病理重點實驗室，廣東 汕頭 515041)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是噬肝病毒屬小包膜DNA病毒。乙型肝炎嚴重威脅人類健康，全球約有3.5億乙肝病毒慢性攜帶者，每年約68.6萬人死于乙肝病毒慢性感染[1]。中國是乙型肝炎大國，慢性乙肝病毒感染者面臨較大的肝硬化和肝癌的風險[2]。現階段治療乙型肝炎的藥物主要有兩類：干擾素(如干擾素α/β等)和類核苷酸類藥物(如拉米夫定、恩替卡韋等)。此外，HBV新藥——多肽類藥物 Myrcludex B[MyrB，HBV功能性受體鈉離子-牛磺膽酸共轉運多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)的抑制劑]正處于II期臨床實驗階段[3]。2012年，李文輝課題組證實NTCP作為功能性受體可以介導HBV及丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)進入肝細胞，為HBV相關研究開啟了一扇嶄新的大門。近年來干細胞技術的快速發展和應用，也有力的推動了HBV研究模型的發展。本文分別從病毒來源、細胞和動物感染模型等方面對HBV研究模型領域的進展進行總結。

1 感染用HBV的來源

1.1 患者血清來源的HBV

天然來源的HBV存在于乙肝患者血液中，HBV表面抗原(HBsAg)、E抗原(HBeAg)和核酸(HBV DNA)均可在其中檢測到。由于HBV在人體中復制速度快且感染能力強，因此血清中HBV DNA的拷貝數達到很高水平。乙肝患者血清來源的HBV可反映肝臟HBV感染情況、患者體內HBV的血清型和基因型、肝組織中HBV共價閉合環狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)和HBV DNA之間的關系。早期分類系統基于表面抗原(HBsAg)的抗原特性將HBV分為ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw3、adw4q-、adrq-和 adrq+等 10 種不同的血清亞型。其依據是：決定簇d/y和w/r的分子基礎是表面抗原(HBsAg)第122和160號氨基酸殘基的K/R轉換，以及其他氨基酸位置決定w1～w4和q的反應性[4]。現已知的HBV基因型有A～J，該分型則是以全基因組測序序列不同進行劃分，不同基因型之間核苷酸序列差異超過8%，因此比血清亞型分型方法更能反映病毒株之間的差異性。HBV基因型呈地理區域性分布，且不同基因型致病性不同。此外，HBV基因型與乙肝病情的臨床表現、發生進展以及預后亦密切相關。

總體而言，乙肝患者血清來源的HBV具有DNA拷貝數高、感染力強等優點，是最接近天然狀態的HBV。其缺點主要是乙肝患者血液來源有限，限制其應用于HBV的相關研究，而且經過抗HBV藥物治療后患者血液中的HBeAg、HBsAg和HBV DNA會降低甚至消失，其中的病毒活力會明顯下降。因此需要其他來源的HBV以替代天然來源的HBV。

1.2 體外細胞培養生產HBV

1.2.1 肝源細胞系生產HBV 穩定表達HBV的細胞系建立后被廣泛應用。1987年，Sells等[5]通過將首尾相連的2倍HBV基因組整合進入HepG2細胞，從而構建成穩定表達乙肝病毒顆粒的HepG2.2.15細胞系。該細胞系中HBV可持續復制，能產生一定量的病毒感染顆粒，并能檢測到cccDNA和松弛環狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)的產生。其產生的病毒上清注射到黑猩猩體內可以誘發顯著的肝炎癥狀。但該細胞系中HBV基因組是整合在細胞染色體上隨細胞的復制而復制，復制方式與自然情況下不同且病毒復制量較低。隨著培養代數增多，其細胞學特性與HepG2會有較大差異，主要抗原表達量會逐漸降低。

HepAD38是由HepG2細胞整合1.1倍的HBV全基因組構建而來，由CMV啟動子和四環素(tetracycline，tet)及其衍生物誘導進行調控表達，由于其前C區基因被破壞，所以HBV DNA的產量比HepG2.2.15細胞要高很多[6]。HepAD79和HepG2-H1.3均整合了1.3倍的HBV全基因組，表達完全靠HBV自身啟動子，更接近于病毒自然狀態[7]。以上這幾種細胞系均為在HepG2細胞染色體中整合不同長度的HBV基因組構建而成的穩定表達HBV的細胞系。

1.2.2 非肝源細胞系生產HBV 目前用于生產HBV的非肝源性細胞非常有限。人宮頸癌細胞系HeLa、小鼠成纖維細胞系NIH3T3等轉染HBV基因組后可以產生HBV病毒顆粒，上清中檢測到HBsAg、HBeAg、HBV DNA。但非肝源細胞裝配和分泌的HBV顆粒與乙肝患者血清來源或肝癌細胞系來源的HBV顆粒有差異，產生病毒量少，且在儲存過程中DNA容易降解，這些缺點束縛了該類細胞系用于HBV生產[8]。

1.3 HBV質粒瞬時轉染生產HBV

綜上，我們將HBV病毒的來源、構建方式、優點和缺點總結如下(見表 1)。

通過瞬時轉染含HBV基因組的質粒是生產HBV另一方法。與穩定轉染HBV的細胞系相比，瞬時轉染的優點是操作步驟簡單，省去了篩選細胞的步驟，轉染速度快、培養時間短、轉染率較高，因此安全性也相對較高。瞬時轉染需要考慮兩個因素：一是選擇能夠支持乙肝病毒表達和復制的細胞系，如肝癌細胞系HepG2，Huh7；二是合適長度的HBV質粒。采用的質粒都包括全長的HBV基因組，往往比HBV本身更長一些。HBV多種基因型大都包含ayw血清亞型，這可能是通常選用HBV的亞型ayw來進行研究的原因。表達HBV的質粒多采用含CMV強啟動子的載體，如pcDNA3等，以啟動下游基因的高表達。另有一些HBV質粒并不含外源啟動子，完全依靠HBV自身啟動子，病毒表達量比強啟動子控制的質粒要低。瞬時轉染HBV質粒后的細胞不適合長期培養[9-10]。

表1 HBV病毒來源比較

2 HBV感染模型

2.1 細胞模型

2.1.1 PHH/PTH細胞 人原代肝細胞(primary human hepatocytes，PHH)支持完整的HBV的感染及復制[11]，接近自然感染過程，是HBV感染研究的金標準。然而，PHH來源有限，不同捐獻者的遺傳背景差異性大[12]。而且PHH體外培養條件嚴格，難以大量擴增，隨著培養時間的延長會較快去分化，喪失部分肝細胞特異性功能(如細胞色素P450水平降低)。這時，PHH的易感性和支持HBV復制的能力均降低[12]。研究表明，PHH體外培養易感性快速下降可能與NTCP的表達量下調有關[13]。樹鼩原代肝臟細胞(primary tupaia hepatocytes，PTH)也可以支持HBV的體外感染。與PHH相比，PTH無論在細胞來源還是經濟性方面都具有顯著的優點。嚴歡等[14]利用PTH等細胞模型發現NTCP是HBV進入宿主細胞的功能性受體，表明PTH是穩定有效的HBV/HDV體外感染研究細胞模型。但PTH也同樣面臨感染效率不高、體外培養過程中對病毒易感性迅速下降等問題。

2.1.2 HepRG細胞 HepRG是一種人肝臟前體細胞系，來源于丙型肝炎引起的肝細胞肝癌女性患者的肝組織，是少數對HBV/HDV易感的細胞系之一[15-16]。當接種密度較低時，該細胞快速分裂并且呈現出一種狹長的未分化形態。但當加入DMSO和氫化可的松琥珀酸酯后，可以分化為兩種類型的細胞：一種是呈現扁平狀、具有清晰細胞質的膽管上皮樣細胞，其周圍則分布著另一種樹突狀肝樣上皮細胞。與一般肝癌細胞系不同，高度分化的HepRG細胞的生物學特性(如細胞色素P450水平和天然免疫因子)很接近PHH，其轉錄組圖譜與PHH也高度相似。能相對穩定的表達持續6周以上，即使停止DMSO誘導后細胞色素P450的表達水平降低，肝特異性轉錄因子和轉運蛋白表達不受影響。HepRG細胞支持HBV的進入、基因組復制、cccDNA形成、感染性病毒顆粒分泌，適用于體外研究HBV生命周期的大部分階段[15]。基于這些特點，HepRG細胞模型已成為一種公認的可以用于抗病毒藥物研發以及評估的有效工具。然而，HepRG仍然有一些不容忽視的缺點，如感染前期DMSO誘導過程耗時長、感染效率不高。

2.1.3 HepCHLine-4和HLCZ01細胞 在NTCP發現以前，蔣嚴等[17]通過融合PHH和HepG2細胞，構建了一種支持HBV體外感染的新型細胞系HepCHLine-4，該細胞系染色體數目是PHH和HepG2細胞染色體數目之和。當用乙肝患者血清感染HepCHLine-4后，能檢測到rcDNA、cccDNA和HBV顆粒的形成，HBsAg、HBeAg、HBcAg也均能檢測到。在連續傳代培養12個月后，該細胞系仍具有對HBV的易感性[17]。另外，Yang等[18]構建了一種能同時支持HBV和HCV體外感染復制全過程的新型肝癌細胞系HLCZ01。該細胞系分離自男性丙肝患者的肝臟腫瘤組織，實驗人員通過兩步膠原灌注法分離、純化腫瘤細胞，然后挑選合適的克隆注射到NOD/SCID免疫缺陷的小鼠體內。兩個月后，分離小鼠的腫瘤組織獲得若干HLCZ01克隆后傳代培養。用HepG2.2.15細胞上清和乙肝患者血清分別感染HLCZ01后，cccDNA和HBV上清標志物均被檢測到。與HepRG不同，HLCZ01不需要DMSO誘導分化即可以支持長達90 d的病毒感染。該細胞系在HBV和HCV共感染時的相互影響、病毒感染時宿主應答機制、研究抗病毒藥物或疫苗開發方面都有較大的應用潛力。

2.1.4 表達外源性NTCP的肝癌細胞系 NTCP是一種跨膜糖蛋白，具有鈉離子依賴性轉運膽汁酸鹽的功能。2012年，李文輝等人發現NTCP是HBV和HDV感染進入肝細胞的功能性受體，NTCP在Huh7和HepG2細胞中的表達水平很低，約為PHH中表達量的1/10 000。Huh7和HepG2等人肝癌細胞系轉染外源性NTCP后，可被HBV和HDV感染[19]。Ni等[20]通過HepRG分化和未分化兩種形態對HBV的易感性進行的研究同樣證實了NTCP的功能。基于此，研究人員通過構建穩定表達NTCP的肝癌細胞系，成功建立了可以支持HBV體外感染研究的細胞系(HepG2-hNTCP、 Huh7-hNTCP、 HepRG-hNTCP、 HEK293-hNTCP等)[14，19-22]。有意思的是，只有在HepG2和Huh7表達人源而非小鼠來源的NTCP時，才具有結合HBV的能力[20]。即人的NTCP包含了HBV表面蛋白PreS1所需的兩個必要的氨基酸序列，其中第157～163號氨基酸序列是結合所必需的，第84～87號氨基酸序列是感染必需的。而鼠的NTCP缺少第84～87號氨基酸序列，因此不能被HBV感染[20]。用人NTCP中對應的氨基酸序列替代小鼠NTCP中這段關鍵序列后，小鼠NTCP即獲得支持HBV感染的能力[21]。

HepRG表達NTCP水平相對穩定，但Schulze等[23]人發現減少HepRG細胞膜間的障礙以便HBV病毒顆粒可以充分與細胞基底側膜接觸，可以有效提高HBV的感染效率。Okuyamadobashi等[24]發現NTCP在HepG2-NTCP細胞的基底膜一側而不是在細胞頂層膜，這限制了貼壁細胞的感染效率，因此發明了一種懸浮感染的方法，可以有效提高感染效率。因此，有效支持體外HBV感染的細胞系必須同時具備表達NTCP且NTCP處于可以與病毒顆粒接觸的狀態。

表達NTCP肝癌細胞系的建立為尋找HBV感染早期尤其是病毒進入過程中新的關鍵因子的發現奠定了基礎。Verrier等[25]用HDV和表達NTCP的Huh7細胞系為模型研究病毒進入過程，發現肝細胞膜表面的GPC5是一種HBV和HDV的結合因子。Michailidis等[26]利用HepG2-NTCP感染模型，發現兩種干擾素刺激基因IS G20、tetherin限制HBV宿主細胞間傳遞。Ko等[27]通過研究HepG2-NTCP細胞系發現DEAD盒RNA解旋酶家族成員DDX3是影響病毒復制的宿主限制性因素。

表達外源NTCP的肝癌細胞系也被用于篩選靶向作用于HBV進入的抗病毒藥物。新發現很多小分子具有抗HBV活性，比如：環孢菌素A[22]、厄貝沙坦[28]等。Myrcludex B是一種人工合成的乙酰化PreS1短肽，可以結合NTCP從而阻斷HBV/HDV 進入[20，29]。

穩定表達NTCP的HepG2和Huh7等肝癌細胞系雖然可以支持HBV感染，但感染效率不高(上清中產生的HBsAg和HBeAg水平都很低，甚至檢測不到HBV DNA)，而用于感染的病毒液滴度甚至高達 6 000～18 000 GEq/cell[19-20，22]。Iwamoto等[22]構建了一株對患者來源和細胞來源的HBV都敏感的細胞HepG2-NTCP-C4。感染前用3%DMSO預處理HepG2-NTCP-C4細胞系，可以提高感染效率至50%。這提示了NTCP可能不是HBV進入過程的唯一受體或因子，DMSO誘導細胞分化可以使其他一些未知的分化依賴性宿主因子表達。因此，尋找病毒進入過程中的次級受體或因子也許是建立體外HBV高效感染模型的一個研究方向。

2.1.5 HLCs細胞 干細胞是一類具有自我更新和多向分化能力的細胞，可以在體外通過特定的條件誘導成為類肝細胞(hepatocyte-like cell，HLCs)。人胚胎干細胞(human embryonic stem cell，hESC)、誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS)、臍帶基質干細胞(umbilical cord matrix stem cells，UMCC)等都可以分化成HLCs，研究證實HLCs支持HBV的感染和復制[30-32]。相比于其他的HBV體外感染模型，HLCs的優點是可以在體外批量生產、便于高通量篩選、可以具有不同的遺傳背景、篩選個性化抗病毒藥物等。間充質干細胞分化獲得的類肝細胞具有成熟的肝細胞功能和分子標志物，Paganelli等[30]用HBV對其進行感染，在細胞的分泌液中檢測到病毒顆粒和病毒蛋白，但病毒的復制效率低，優點是該細胞來源廣泛，適用于HBV感染的早期研究。Xia等[31]誘導hESC和iPS成功分化為HLCs，90%分化后的細胞可以穩定表達PHH的標志物，如白蛋白、感染所需的特定細胞因子等，且NTCP的表達比PHH更穩定。用HBV病毒顆粒感染HLCs，HBV DNA、cccDNA、pgRNA、HBeAg和HBsAg都可以被檢測到，并且應用該細胞系驗證了2種宿主靶向抗病毒化合物：genistin和PA452[31]。然而干細胞培養和誘導分化成本高，誘導分化過程耗時長[33]。相信隨著干細胞技術的不斷發展，HLCs作為HBV體外感染模型將會有更加廣闊的應用。

2.2 動物模型

2.2.1 黑猩猩模型 黑猩猩是理想的模擬HBV自然感染過程的動物模型。早在二十世紀六七十年代，科學家就已經發現黑猩猩可以被乙肝病毒感染。八十年代后，黑猩猩才被作為模型用來模擬HBV感染人的過程。黑猩猩與人類無論在遺傳背景還是生理特征上都高度相似，因此該模型擁有獨特的優越性。用HBV陽性患者血清感染黑猩猩后，可以使其產生急性感染和慢性感染，同時可以產生肝臟炎癥以及與HBV感染患者相仿的免疫應答[34]。黑猩猩模型已經被用于HBV感染的發病機制研究、治療性疫苗療效評價、抗病毒藥物篩選等。但使用黑猩猩模型進行研究的花費十分高昂，而且涉及動物倫理，限制了該模型的廣泛使用。Dupinay等[35]近期報道一種生活在毛里求斯島的食蟹猴，可被來自人類的HBV自然持續感染，可作為HBV感染動物模型。

2.2.2 樹鼩模型 樹鼩作為HBV感染的宿主被科研人員發現則是在二十世紀八十年代[36]。其外形與松鼠相似，成年后體長通常約140～195 mm，主要分布在中國西南省份和東南亞各國，屬樹鼩科樹鼩屬。但成年動物人工感染HBV后常表現為急性感染，感染HBV的樹鼩肝組織中發現HBV DNA的復制，血液中也出現了HBsAg的表達，還能產生包括HBsAb和HBcAb在內的針對病毒抗原的抗體。幼齡期動物感染HBV較易形成慢性感染，與人類HBV感染過程相似。由于樹鼩是野生動物，個體差異較大，實驗重復性差。為了解決這個問題，我國學者組建了較大規模的人工繁育樹鼩種群，深入開展了遺傳學和基因組學相關研究，這些工作將促進樹鼩成為可以廣泛應用的HBV感染動物模型[37]。

2.2.3 人源化小鼠模型 將PHH移植到尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)轉基因的免疫缺陷(SCID)小鼠中，該模型已經成功應用于HBV和HCV的感染，并且可以支持HBV生命周期的全部過程，但是與PHH一樣，該模型也是一個特定基因型的有限原代肝細胞來源。該嵌合小鼠模型分離出的PHH表現出相當高的細胞色素P450酶和葡萄糖醛酸基轉移酶活性。在PEG的作用下，80%的細胞可被感染，且上清中可以持續檢測到HBV DNA。此外，將PHH移植到延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)缺陷的小鼠(FRG)中，可使FRG小鼠中人肝細胞比例將達到95%[38]。雖然構建人肝嵌合小鼠模型費用高、步驟復雜，但可以將PHH擴增500～1 000倍，可提供較多對HBV高度易感的PHH；且獲得具有單一基因型的肝細胞，減少了不同批次PHH差異性大的問題，增強了相關研究的可重復性和穩定性[39]。基于上述兩種小鼠模型都是免疫缺陷模型，不適用于HBV感染過程中免疫應答相關研究。因此，有人提出通過多種策略構建人免疫細胞和人肝細胞雙嵌合小鼠模型，如AFC8和A2/NSG小鼠模型[40]。這種模型能更好的模擬肝炎病毒感染過程中的免疫反應。

3 小結

HBV感染模型研究的發展對揭示病毒與宿主相互作用及反應機制等方面起了非常重要的作用，但仍有許多局限要克服突破。體外培養的PHH對病毒易感性低。HepRG細胞培養流程復雜，常常需要長達1個月以上的誘導分化過程。穩定表達NTCP的肝癌細胞系只能部分反映PHH的特性。各種細胞模型對感染時病毒滴度要求不一致，感染時使用了PEG和DMSO，不能真實模擬HBV感染人肝細胞時的侵入過程。現有的HBV體外感染細胞模型合成cccDNA的水平較低，而cccDNA是慢性HBV感染建立的關鍵，cccDNA在宿主細胞核內長期存在且目前沒有可以將其有效清除的藥物。作為篩選新的抗病毒藥物的重要靶點，人們對cccDNA的認識十分有限，因此開發新的能夠形成較高水平cccDNA的細胞模型，充分研究其形成和調節機制，尤為迫切。近年來HBV體外感染模型研究取得了令人矚目的進展，一些新技術如干細胞技術的應用也為新的HBV體外感染模型提供了支持。研究顯示人誘導多能性干細胞來源和人胚胎干細胞來源的HLCs其HBV感染率最高能達到90%，與PHH最高感染率100%最為接近，且HLCs感染后產生HBsAg和HBeAg的水平與PHH接近[41]。因此HLCs的應用為HBV感染研究提供了新的工具[32]。隨著現有HBV感染研究模型的不斷發展，以及新技術的應用，未來人們在乙肝病毒感染發生機制、病毒和宿主間的相互作用、新疫苗和抗病毒新藥的研發等領域會取得更加豐富的成果。